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1、急性移植腎排斥反應(yīng)類固醇沖擊治療后淋巴細(xì)胞凋亡的作用作者：張波王禾張紹增武國(guó)軍李欣楊曉劍于磊張更【關(guān)鍵詞】腎移植 Studyonapoptosisoftubularepithelialcellsandlymphocyteinacuterejectionofrenalallograftaftersteroidpulsetherapy 【Abstract】AIM:Toexplorethechangesofapoptosisoftubularepithelialcellsandlymphocyteinacuterejectionofrenalallograf
2、taftersteroidpulsetherapy.METHODS:Renalbiopsyspecimensof64transplantrecipientsinedforapoptosis.Biopsiesedaftersteroidpulsetherapyandphocyteinfiltration.ApoptosiscellsofgraftsonitoredbyterminaldeoxynucleotidyltransferasemediateddUTPdigoxigeninnickendlabeling(TUNEL)analysis.RESULTS:
3、TheTUNELshophocytesphocyteapoptosis(P＝0.000).AccordingtotheBanffclassification,16casesphocyteapoptosisphocyteapoptosisisaphenomenonpredominantlyrestrictedtorejectionprocesses,ayberelatedtotheprognosisofacuterejection. 【Keyo.急性排斥反應(yīng)發(fā)生前血Cr為(118±17)μmol・L-1，發(fā)生中為(411±192)μmol&#
4、12539;L-1.發(fā)生急性排斥后連續(xù)3d用甲基強(qiáng)地松龍（第1日500mg，第2，3日分別為250mg）沖擊治療.在沖擊治療后第3日于B超或CT介導(dǎo)下用Menghini或Trucut穿刺針進(jìn)行移植腎穿刺活檢.對(duì)照組選取有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的非排斥反應(yīng)的移植腎活檢標(biāo)本40(男26，女14)例，平均年齡35歲. 1.2試劑原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（insitucellapoptosisdetectionkitI，POD），購(gòu)自武漢博士德公司，地高辛標(biāo)記的三磷酸脫氧尿苷（DIGDUTP），德國(guó)BochringerMannhEim公司；末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（TdT），
5、美國(guó)Promega公司；蛋白酶K、生物素標(biāo)記的抗地高辛抗體（AntiDIGBiotin），美國(guó)Sigma公司. 1.3方法 1.3.1急性排斥的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)①患者有發(fā)熱、頭昏、倦怠、血壓升高、食欲減退、腹脹、并排除明顯肺部感染、上呼吸道感染、尿路感染等并發(fā)癥.②移植腎腫大和疼痛.有局部壓痛、質(zhì)地變硬、體積增大，并排除腹水壓迫致移植腎疼痛或輸尿管梗阻.③移植腎功能減退.表現(xiàn)為尿量減少，水、鈉潴留，體質(zhì)量迅速增加，血壓升高，血Cr迅速上升,超過原來值的25%，并排除CsA腎毒性. 1.3.2標(biāo)本制備活檢標(biāo)本用升汞甲醛液固定10min后，然后放入Db液中固
6、定.常規(guī)石蠟包埋，切片.各例切片做常規(guī)蘇木素伊紅（HE）和PAS染色，顯微鏡觀察，進(jìn)行病理診斷. 1.3.3實(shí)驗(yàn)步驟和判斷標(biāo)準(zhǔn)移植腎活檢標(biāo)本石蠟切片常規(guī)脫蠟至水體積分?jǐn)?shù)為3mL・L-1新鮮H2O2處理、蒸餾水洗滌；加Tris緩沖液（TBS）1∶100新鮮稀釋蛋白酶K，37℃，10min，蒸餾水洗；加含TdT和DIGdUTP的標(biāo)記緩沖液20μL，37℃，2h，TBS洗滌；加封閉液50μL，室溫30min，甩干；加封閉液1∶100稀釋的抗地高辛抗體55μL，37℃，30min，TBS洗滌；加TBS1∶100稀釋的鏈霉親合素生物素過氧化酶復(fù)合物（
7、SABC），37℃，30min，TBS洗滌；DAB顯色20min，蒸餾水洗，蘇木素復(fù)染，TBS洗；脫水，透明，封片.顯微鏡觀察，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為凋亡細(xì)胞.計(jì)算移植腎中10個(gè)腎小球1000個(gè)細(xì)胞中發(fā)生凋亡的浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞或腎小管上皮細(xì)胞為5～10時(shí)用“+”表示，10～20個(gè)時(shí)為“”，>20個(gè)時(shí)為“”. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPLM軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,統(tǒng)計(jì)方法為Willcoxon秩和檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著意義. 2結(jié)果 2.1急性排斥反應(yīng)組與對(duì)照組凋亡細(xì)胞分布情況在急性排斥反應(yīng)組中44例病例觀察到淋巴細(xì)胞，34例患者觀察到腎
8、小管上皮細(xì)胞凋亡，20例未檢測(cè)到細(xì)胞凋亡，而對(duì)照組淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡
