顆粒酶在心臟移植急性排斥反應(yīng)中作用

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1、顆粒酶在心臟移植急性排斥反應(yīng)中作用【關(guān)鍵詞】顆粒酶;心臟移植;急性排斥反應(yīng)心臟移植是治療終末期心臟病的有效方法,雖然已有多種免疫抑制劑廣泛應(yīng)用于臨床,但心臟移植的術(shù)后并發(fā)癥主要仍是排斥反應(yīng),其中最常見(jiàn)的是急性排斥反應(yīng)。治療的關(guān)鍵在于如何早期確定急性排斥反應(yīng)的嚴(yán)重程度以確定是否需用免疫抑制藥物,在移植物造成細(xì)胞性損傷前逆轉(zhuǎn)排斥反應(yīng)[1]。同種異體移植的急性免疫排斥反應(yīng)是由多種調(diào)節(jié)因子,效應(yīng)細(xì)胞間復(fù)雜相互作用的結(jié)果。細(xì)胞免疫應(yīng)答在急性排斥反應(yīng)中發(fā)揮主要作用,其中CD8?+T細(xì)胞是重要的效應(yīng)細(xì)胞。CD8

2、?+T細(xì)胞主要通過(guò)穿孔素、顆粒酶途徑殺傷靶細(xì)胞[2]。?5具有殺傷作用的CTL細(xì)胞經(jīng)抗原激發(fā),活化成為效應(yīng)細(xì)胞,活化的CTL可通過(guò)顆粒-胞吐途徑介導(dǎo)的溶細(xì)胞作用殺傷靶細(xì)胞?；罨腃TL胞漿的顆粒中含有穿孔素和顆粒酶。CTL與靶細(xì)胞通過(guò)T細(xì)胞受體(TCR)特異識(shí)別并連接,CTL胞漿中的顆粒定向移位于接觸部位,通過(guò)細(xì)胞排粒,顆粒中的穿孔素和顆粒酶釋放到細(xì)胞間隙,穿孔素以單體形式插入靶細(xì)胞膜,形成“孔道”,促使顆粒酶進(jìn)入靶細(xì)胞,引起靶細(xì)胞DNA斷裂,導(dǎo)致靶細(xì)胞凋亡?；罨腃TL與靶細(xì)胞的接觸由Mg2+依

3、賴,一旦靶細(xì)胞凋亡結(jié)束,CTL就在缺乏Mg2+的狀態(tài)與靶細(xì)胞脫離,參加再循環(huán);再循環(huán)CTL可對(duì)靶細(xì)胞重復(fù)殺傷5~7次,此后失去殺傷活性當(dāng)靶細(xì)胞數(shù)多于CTL時(shí),CTL的再循環(huán)發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。?顆粒酶分子顆粒酶是一組同源性的絲氨酸蛋白酶,人顆粒酶包括GzmA、B、K、H等成員,與PFN一起存在于活化的CTL和NK細(xì)胞胞漿顆粒中,是CTL和NK細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒的主要效應(yīng)分子。人GzmA基因定位于5號(hào)染色體上。GzmA分子為由兩個(gè)單體通過(guò)二硫化合物連接成相對(duì)分子質(zhì)量為60000的同源二聚體,具有類胰蛋白

4、酶的性質(zhì),在體內(nèi)能緩慢引起靶細(xì)胞DNA斷裂。人GzmB基因定位于14號(hào)染色體上,酶相對(duì)分子質(zhì)量有30000,32000,350003種,經(jīng)葡萄糖昔酶水解后均剩下1個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為27000的蛋白核心,說(shuō)明3種形式的GzmB是同一蛋白帶有不同的糖基[4]。GzmB具有天門冬氨酸酶的活性,是主要效應(yīng)分子,能迅速引起靶DNA斷裂,作用強(qiáng)于GzmA,其純化的單克隆抗體已廣泛地應(yīng)用于研究中。Gzms之間高度同源,其包含胰蛋白酶家族絲氨酸蛋白酶的催化性三聯(lián)體His-57,Asp-102,Ser-195。其他特

5、征包括:N端Ile-Ile-Gly-Gly序列;含有3-4個(gè)二硫鍵;含有一個(gè)同樣出現(xiàn)于中性粒細(xì)胞組織蛋白酶(cathepsin)G5、肥大細(xì)胞食糜酶(chymase)的保守基序(PHSRPYMA)。?5顆粒酶與穿孔素協(xié)同發(fā)揮作用。穿孔素和顆粒酶B對(duì)雙標(biāo)記靶細(xì)胞(51Cr標(biāo)記靶細(xì)胞胞漿蛋白質(zhì),125I-Udr標(biāo)記靶細(xì)胞DNA)的作用實(shí)驗(yàn)表明,單用穿孔素引起51Cr釋放但無(wú)125I釋放;單用顆粒酶B不能引起任何釋放;只有穿孔素和顆粒酶B同時(shí)存在時(shí),才能測(cè)到51Cr和125I同時(shí)迅速釋放。這一試驗(yàn)證實(shí)了

6、穿孔素引起靶細(xì)胞膜受損,顆粒酶B隨后引起靶DNA斷裂。GzmB在穿孔素存在時(shí),在靶細(xì)胞漿內(nèi)再分布,集中于細(xì)胞核時(shí),才導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在無(wú)穿孔素存在的情況下,顆粒酶B能夠通過(guò)能量依賴途徑穿過(guò)細(xì)胞膜,進(jìn)入細(xì)胞漿內(nèi),但細(xì)胞并無(wú)明顯的損害。這是因?yàn)镻FP可引發(fā)凋亡和影響顆粒酶B向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。?顆粒酶B進(jìn)入細(xì)胞后通路何種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡尚還不完全清楚?，F(xiàn)有的資料顯示,GzmB可以在細(xì)胞質(zhì)、線粒體和細(xì)胞核三個(gè)層次作用于不同的分子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究顯示:GzmB可能經(jīng)由Caspases途徑殺傷細(xì)胞:Ca

7、spases是一組半膚天冬蛋白酶,細(xì)胞凋亡信號(hào)可引起Caspase激活。無(wú)活性酶原(pro-caspases)內(nèi)部?jī)蓚€(gè)保守性Asp殘基被特異酶切后形成雙鏈,以類似酶原激活方式呈級(jí)聯(lián)放大效應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。試驗(yàn)表明,GzmB能切割作為DNA損傷修復(fù)傳感分子的PARP,產(chǎn)生1個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為54000或41000的片段,而caspase-3的切割產(chǎn)物是1個(gè)89000的片段。GzmB在體外和體內(nèi)試驗(yàn)中均能迅速切割DNA-PKcs和NuMA,但所得產(chǎn)物片段與caspase-3切割所得有所不同。將PFN與G

8、zmA/GzmB共同在37℃作用于K562細(xì)胞,用抗lamin5B的單抗作探針,見(jiàn)GzmA對(duì)laminB的切割不被caspase的抑制劑所阻斷。提示Gzms對(duì)lamin可以直接切割,而不依賴caspase途徑。GzmB對(duì)caspase-7和caspase-10的切割是所有已知Gzms中最有效的,30min內(nèi)90%的caspase-7和caspase-10即被有效切割。這一過(guò)程可由PFN/GzmB或由Fas/FasL介導(dǎo)。故有理論認(rèn)為:GzmB可能并不直接切割產(chǎn)生有活性的成熟casp