同種異體心臟移植急性排斥反應(yīng)的無創(chuàng)監(jiān)測論文

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1、同種異體心臟移植急性排斥反應(yīng)的無創(chuàng)監(jiān)測論文馬濤，胡軍，蔡振杰，李彤，王曉武，程亮【摘要】目的:觀察同種異體心臟移植術(shù)后血清C反應(yīng)蛋白（CRP）的動態(tài)變化，探討監(jiān)測其血清濃度水平在評價(jià)移植成活質(zhì)量及判斷心臟排斥反應(yīng)的作用.并研究體外單項(xiàng)混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)作為無創(chuàng)心臟移植排斥反應(yīng)監(jiān)測方法及意義.方法:26例原位心臟移植患者手術(shù)前后及心內(nèi)膜心肌活檢（EMB）時(shí)同期監(jiān)測受體血清CRP濃度水平，依術(shù)后30d內(nèi)受體是否成活分為成活組（n=24）與死亡組（n=2）；依EMB標(biāo)本（n=32）病理等級（ISHLT）分為陰性組（0.freelixedlymphocyt

2、eculture，MLC）技術(shù)進(jìn)行改良，采取心臟移植受體外周血淋巴細(xì)胞體外混合培養(yǎng)以期準(zhǔn)確而無創(chuàng)監(jiān)測心臟移植后急性排斥反應(yīng).1對象和方法1.1對象截止20030926我科心臟移植患者26（男21，女5）例，年齡12～68歲，體質(zhì)量31～86（平均59±14）kg.其中17例為擴(kuò)張性心肌病，4例為缺血性心肌病，3例為克山病，1例先心病，1例為冠心病搭橋術(shù)（CABG）后.心功能（NYHT）III級4例，Ⅳ級22例.術(shù)前超聲心動圖示左室射血分?jǐn)?shù)（EF）0.21～0.42，平均0.31±0.09；術(shù)前右心導(dǎo)管檢查示肺動脈收縮壓（PAP）32～56（平均

3、45±12）mmHg（1mmHg=0.133kPa）；肺小血管阻力1.3～6.33（平均2.95±0.8）MF2g/d(分2次口服)，術(shù)中開始體外循環(huán)前將甲基強(qiáng)的松龍1000mg加入預(yù)充液中，停機(jī)后再靜脈推注甲基強(qiáng)的松龍500mg.術(shù)后采用FK506,MMF（驍悉）和潑尼松三聯(lián)免疫方法，給予甲基強(qiáng)的松龍5mg/（kg·d），持續(xù)1g/(kg·d)，總量每日遞減5mg，直至15mg維持半年；FK506用量為0.1～0.33mg/(kg·d)，術(shù)后1mo維持血中FK506的谷值在15～25μg/L，3mo后為5～15μg/L；MMF用量為2.0g/d，

4、分2次口服，術(shù)后半年減至1.0g/d，分2次口服.術(shù)后1mo行心肌內(nèi)膜活檢(endomyocardialbiopsy,EMB)時(shí)抽取外周靜脈抗凝血，分離外周淋巴細(xì)胞.在獲取腦死亡心臟移植供體心臟時(shí)，同時(shí)無菌切取部分供體脾臟，以制備供體淋巴細(xì)胞樣本.1.2方法1.2.1CRP檢查采取受體外周靜脈血離心后ELISA法檢測，移植前檢查1～2次，移植后每天檢查1次至1mo，在受體復(fù)查及心內(nèi)膜心肌活檢時(shí)同期檢查.其參考的正常范圍0.2～5.0mg/L.1.2.2心內(nèi)膜心肌活檢（endomyocardialbiopsy,EMB)心臟移植后3mo內(nèi)做活檢1～2次

5、，3mo后每隔6mo左右檢查一次，懷疑發(fā)生排斥反應(yīng)時(shí)隨時(shí)做.每次活檢均在局麻、X線引導(dǎo)下取右心室室間隔處標(biāo)本，40g/L甲醛固定液固定做病理和2.5g/L戊二醛固定液固定做電鏡檢查.病理切片石蠟包埋，HE染色，急性心臟排斥反應(yīng)等級按照ISHLT（InternationalSocietyofHeartandLungTransplantation）1990年分級標(biāo)準(zhǔn)（0～4等級）進(jìn)行排斥反應(yīng)分析.1.2.3混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)①供體淋巴細(xì)胞的制備在RPMI1640培養(yǎng)液中研磨供體脾臟，將細(xì)胞懸液離心10min，加入溫?zé)崧然@溶解紅細(xì)胞，再次離心10min

6、，全部吸取中層灰色細(xì)胞層，生理鹽水離心清洗2次，臺盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù).調(diào)整細(xì)胞密度為2×109/L，分成3管，各自離心,每管中加入250μL絲裂霉素（終濃度50mg/L）和1.75mL生理鹽水，37℃水浴40min，生理鹽水離心洗滌2次.用含100mL/L胎牛血清的RPMI1640液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×1010/L.-70℃冰箱凍存?zhèn)溆?在進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，37℃水浴解凍，生理鹽水洗滌1次，用含120mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×1010/L.標(biāo)記為D.②受體淋巴細(xì)胞的制備新鮮外周靜脈血按1∶1比例加在裝有比重

7、為1.077的淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，離心20min，吸取中間霧狀淋巴細(xì)胞層.生理鹽水洗滌2次.用含120mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×1010/L.標(biāo)記為R.③混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及分組將已制備好的R和D按如下分組加入96孔板，置37℃，50mL/LCO2孵箱中培養(yǎng)24h.A組：R50μL+D50μL；B組：R50μL+D50μL+IL2純化中和單抗15μL；C組：R50μL+IL2純化中和單抗15μL；D組：R50μL.每組3個(gè)復(fù)孔，空白對照組RPMI1640培養(yǎng)液100μL.④酶標(biāo)分析儀檢測培養(yǎng)24h后，每孔

8、加入MTT試劑（5mg/L）15μL，繼續(xù)37℃，50mL/LCO2孵箱中培養(yǎng)2～4h.離心20min，棄上清，每孔加入D