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《當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)荷瘤小鼠化療后免疫功能的影響論文》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)荷瘤小鼠化療后免疫功能的影響論文.freelide,CTX)化療荷瘤小鼠免疫功能的影響。方法建立S180荷瘤小鼠模型后,隨機(jī)分為4組,荷瘤對(duì)照組、CTX組、當(dāng)歸補(bǔ)血湯+CTX組及當(dāng)歸補(bǔ)血湯組。造模次日開始給藥.freelide,CTX)化療荷瘤小鼠免疫功能的影響,旨在為該方的臨床應(yīng)用提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料與儀器1.1動(dòng)物及細(xì)胞株清潔級(jí)昆明小鼠,7~9周齡,雌雄各半,體質(zhì)量18~22g,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證:SCXK(冀)2003-1-003。動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性馴養(yǎng)1周。飼料和墊料由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)期間自由采食飲水。腹水型S180瘤株由河北醫(yī)科
2、大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,L929細(xì)胞株由北京市中醫(yī)研究所提供。1.2藥品當(dāng)歸補(bǔ)血湯由黃芪和當(dāng)歸組成(飲片由河北大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供,所有藥品均經(jīng)中藥專家鑒定),將上述藥物加水浸泡20min后,煎煮3次,約30min/次,3煎溶液混合過濾,取汁300ml,離心取上清,80℃水浴濃縮至每毫升含生藥1.2g,分裝,高溫消毒后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆??;熕幬铮鹤⑸溆铆h(huán)磷酰胺,江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司(批號(hào):06112021)。1.3試劑及儀器DMSO(Amresco公司產(chǎn)品),四氮甲唑藍(lán)(MTT,Amresco公司產(chǎn)品),刀豆蛋白A(ConA,Sigma公司產(chǎn)品),RPMI-1640完全培養(yǎng)基(Amr
3、esco公司產(chǎn)品)。酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司產(chǎn)品),CO2培養(yǎng)箱(上海?,攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品),超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品),倒置顯微鏡(南京江南永新光學(xué)有限公司產(chǎn)品)。2方法2.1動(dòng)物模型的建立[2]無菌條件下抽取6~7d生長良好的S180小鼠的腹水,按1∶3比例用生理鹽水稀釋,反復(fù)沖打,充分混勻,在顯微鏡下計(jì)數(shù),用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×107/ml,取0.2ml于每只小鼠右側(cè)腋窩下碘酊消毒后皮下接種。瘤株接種前,均用0.2%臺(tái)盼藍(lán)染色,計(jì)算活細(xì)胞數(shù)為95%~98%。從抽取腹水時(shí)開始,到移植完最后1只小鼠的總時(shí)間控制在1h內(nèi)。2.2分組及給藥小鼠
4、接種24h后按體質(zhì)量和性別隨機(jī)分成荷瘤對(duì)照組、CTX組、當(dāng)歸補(bǔ)血湯+CTX組和當(dāng)歸補(bǔ)血湯組。荷瘤對(duì)照組均用生理鹽水灌胃,同時(shí)腹腔注射生理鹽水,單純化療組腹腔注射CTX0.02g·kg-1·d-1,同時(shí)用生理鹽水灌胃,當(dāng)歸補(bǔ)血湯+CTX組腹腔注射CTX0.02g·kg-1·d-1,同時(shí)用當(dāng)歸補(bǔ)血湯12g·kg-1·d-1(按生藥量計(jì)算,劑量由預(yù)實(shí)驗(yàn)得出)灌胃,當(dāng)歸補(bǔ)血湯組用當(dāng)歸補(bǔ)血湯12g·kg-1·d-1灌胃,同時(shí)腹腔注射生理鹽水,各組灌胃容積均為0.4ml/只,腹腔注射容積均為0.2ml/只,各組于瘤細(xì)胞接種第2日開始用藥,1次/d,連續(xù)10d。2.3脾臟、胸腺指數(shù)小鼠脫臼處死,以無菌操作
5、取下脾臟、胸腺,電子天平稱質(zhì)量并計(jì)算臟器指數(shù)。2.4腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的測(cè)定[3]小鼠脫臼處死,75%酒精中浸泡2min,置超凈臺(tái)。每只小鼠腹腔注射冷PBS液10ml,輕揉腹部2min,回抽腹腔液,離心棄上清。RPM1-1640培養(yǎng)液洗兩次,計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml,加入96孔培養(yǎng)板,每孔100μl,每樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h,溫PBS液洗并吸出未貼壁細(xì)胞,得到巨噬細(xì)胞單層。于每孔中加入0.03%的中性紅溶液100μl,置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h,用溫PBS液反復(fù)沖洗未被吞噬的中性紅3次。于每孔中加入細(xì)胞裂解液(1∶1的冰醋酸和無水乙醇)100μl,4℃
6、靜置過夜,用酶標(biāo)儀在570nm處測(cè)定OD值。2.5NK細(xì)胞活性測(cè)定[4]無菌摘取脾臟,按常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液,用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液配成1×107/ml濃度作為效應(yīng)細(xì)胞。取傳代培養(yǎng)的L929細(xì)胞,用0.25%胰酶消化液消化2min,加入完全RPMI-1640培養(yǎng)液,調(diào)細(xì)胞濃度為2×105/ml作為靶細(xì)胞,在96孔平底板上每孔加入靶細(xì)胞懸液100μl,37℃,5%CO2培養(yǎng)90min,使其貼壁成單層細(xì)胞,然后實(shí)驗(yàn)孔加入100μl效應(yīng)細(xì)胞懸液,做4個(gè)復(fù)孔,靶細(xì)胞對(duì)照孔加完全RPMI-1640培養(yǎng)液100μl;然后將96孔板放在37℃,5%CO2孵箱中孵育20h,去上清,用生理
7、鹽水輕輕注滿各孔,反復(fù)3次,以除去效應(yīng)細(xì)胞和被殺傷脫落的靶細(xì)胞,在濾紙上吸干孔內(nèi)水分;每孔加入0.1%的中性紅染液100μl,孵育30min,棄去染液,用生理鹽水洗3遍,每孔加100μl細(xì)胞裂解液,使含有中性紅的靶細(xì)胞溶解,搖勻,用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)OD值,用以下公式計(jì)算殺傷率。殺傷率(%)=(靶細(xì)胞OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/靶細(xì)胞OD值×100%2.6T淋巴細(xì)胞增殖能力的測(cè)定[5]無菌摘取脾臟,常規(guī)制作脾細(xì)