骨組織形態(tài)計量學(xué)在骨折愈合實驗研究中的應(yīng)用

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1、骨組織形態(tài)計量學(xué)在骨折愈合實驗研究中的應(yīng)用摘要：骨組織形態(tài)計量學(xué)是對骨組織進(jìn)行定量描述的一門技術(shù)。目前用于骨質(zhì)疏松的研究較多，但用于骨折愈合的研究不多?；仡櫫嗽摲椒ㄔ诠钦塾蠈嶒炑芯恐械闹饕夹g(shù)步驟及我們的經(jīng)驗，并對相關(guān)參數(shù)做了詳細(xì)描述。關(guān)鍵詞：骨組織形態(tài)計量學(xué)；骨折愈合；實驗研究1引言骨組織形態(tài)計量學(xué)（Bonehistomorphometry），是對骨組織進(jìn)行定量描述的一門技術(shù)，目前主要通過對顯微鏡下骨組織二維平面的測量，根據(jù)體視學(xué)原理，推測或轉(zhuǎn)換獲得三維參數(shù)〔1〕。其基本原理為Cavalieri原理和Delesse原理。Cavalieri原理由17世紀(jì)意大利數(shù)學(xué)家Cavalieri提出

2、，其含義是將物體等距做數(shù)個切面，各切面的面積之和（∑a）與切面之間距離（d）的乘積，即可求得物體的絕對體積，用公式表示為：V=∑a・d。Delesse原理由19世紀(jì)法國地質(zhì)學(xué)家Delesse提出，是最基本、最簡單、最實用的原理之一，用它可求得面積分?jǐn)?shù)（面積密度AA）和體積分?jǐn)?shù)（體積密度VV），用公式表示為：AA=∑A/∑AO=VV（∑A為切面內(nèi)特征物面積之和，∑AO為切面內(nèi)參照面積之和）。體視學(xué)在材料學(xué)、地質(zhì)學(xué)中開展較早，稱“定量金相”。1968年，國際體視學(xué)會成立，開始并迅速普遍用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。通過1973年3月（加拿大）、1976年3月（法國）、1980年3月（美國）3

3、次骨組織測量學(xué)國際學(xué)術(shù)會的召開，為該方法在骨科領(lǐng)域的應(yīng)用打下了基礎(chǔ)〔2〕。1988年，中國體視學(xué)學(xué)會和中國生物醫(yī)學(xué)體視學(xué)會正式成立，體視學(xué)的方法開始在國內(nèi)得到推廣和應(yīng)用。因此，骨組織計量學(xué)用于骨科在國內(nèi)僅10余年時間。目前應(yīng)用最多的是用于骨質(zhì)疏松的研究，而在骨折愈合中則較少，二者盡管有許多相同的地方，卻也存在明顯不同，對此尚需進(jìn)一步探討。2主要技術(shù)步驟根據(jù)我們的經(jīng)驗，其主要技術(shù)步驟為標(biāo)本制備→采圖→測量→轉(zhuǎn)換為參數(shù)→結(jié)論。2．1標(biāo)本制備實驗動物選家兔比大鼠好，因其更易制作硬切片。涉及到四環(huán)素標(biāo)記、取材、固定、脫水、包埋、制片、染色等步驟。2.1.1四環(huán)素標(biāo)記若要獲得動態(tài)參數(shù)，需對動物行四環(huán)

4、素族藥物活體標(biāo)記，如四環(huán)素、土霉素、金霉素口服或肌注均可，目的是了解骨礦化動態(tài)過程。進(jìn)行雙標(biāo)時為獲得可靠標(biāo)記結(jié)果，每次標(biāo)記最好連續(xù)2天，末次標(biāo)記在取材前2～3天，2次標(biāo)記間隔時間兔以6天為最佳。如第4、5天行第一次標(biāo)記，則第11、12天行第二次標(biāo)記。2.1.2取材一般在兔橈骨中段造成3mm寬缺損后，以該處為中心共取2cm長橈骨標(biāo)本。動作要輕柔，以防再次骨折影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。2.1.3固定一般采用10%的福爾馬林緩沖液（pH7.0～7.1）或70%乙醇或100%乙醇固定3天。對于四環(huán)素標(biāo)記的標(biāo)本以乙醇固定為好，福爾馬林溶液可使標(biāo)記的顏色減退。2.1.4脫水用酒精從低濃度到高濃度梯度脫水，若采

5、用80%的固定濃度則勿需脫水。2.1.5包埋包埋劑一般用甲基丙烯酸甲酯和鄰苯二甲酸二丁酯，臨用時以3∶1比例混合，加過氧化苯甲酯適量，可起催化作用。包埋過程中注意負(fù)壓抽氣，防止氣泡形成。2.1.6制片傳統(tǒng)對骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察，一般多用硬骨磨片和脫鈣后切片。這些方法各有其不如人意之處，如：硬骨磨片易破裂、不完整；脫鈣后切片易變形、失真，使骨組織很重要的成分礦物質(zhì)丟失。目前，在骨組織的形態(tài)計量學(xué)研究中，學(xué)者們都認(rèn)為采用鋸片后磨片和不脫鈣切片較為理想〔3〕。但我們認(rèn)為，鋸片后磨片費時、費力，過程復(fù)雜，一般研究人員難以掌握，其片子厚度也較厚，約為20～30μm，由于投影過多、投影過少、截尾效應(yīng)將

6、影響部分?jǐn)?shù)據(jù)的觀察；而采用JungK、LEiCASM等重型切骨機(jī)行不脫鈣切片，根據(jù)需要，可準(zhǔn)確獲得不同厚度的切片（5～10μm），簡捷、省時、準(zhǔn)確。2.1.7染色染色方法需根據(jù)測量目的而選擇，如Toluidineblue（甲苯胺藍(lán)），可清晰地顯示礦化骨小梁、類骨質(zhì)、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞；Masson染色可清晰區(qū)分類骨質(zhì)、礦化骨小梁，但不易區(qū)分細(xì)胞；H．E染色可區(qū)分細(xì)胞，但不如甲苯胺藍(lán)清晰。其他〔4〕尚有VonKossa氏法、SolochromeCyaninR、Goldnen’sTrichrome等，還有像改良的Giemsa、PAS、AB-PAS等。每一種染色方法，無論單一的還是復(fù)合的，都使各

7、種組織成分有特定的著色，以便于鏡下精確地辨認(rèn)。2．2采圖現(xiàn)在一般都采用一套將顯微攝像與計算機(jī)相連的特殊圖像采集系統(tǒng)（如NikonSpot圖像采集系統(tǒng)）采圖。采圖需注意樣本的代表性與可比性。應(yīng)遵循等距隨機(jī)抽樣的原則；同一標(biāo)本的照片或視場數(shù)的增加并不代表實際研究例數(shù)的增加；不同標(biāo)本的采圖部位應(yīng)基本一致，如均在外骨痂或內(nèi)骨痂，以使其具有可比性。采圖的同時最好用標(biāo)尺定好標(biāo)。2．3測量切片制成后就可以進(jìn)行測量，目前較常用的測量方法