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1、大鼠海馬錐體神經(jīng)元延遲整流鉀電流的發(fā)育變化論文【摘要】目的研究大鼠海馬錐體細胞延遲整流鉀電流（IK）在出生后不同發(fā)育階段的變化。方法采用膜片鉗全細胞記錄模式比較3個不同年齡組，即出生后7～10天（P7-10組）、25～30天（P25-30組）和56～60天（P56-60組）ethodsgSO42，NaHCO326，葡萄糖10，CaCl22，pH7.20〕，于冰盒上分離海馬，并將海馬切成400～500μm的薄片（冠狀切片），隨后將腦片移入充氧的ACSF內(nèi)孵育1h，將腦片移入充氧的含0.05%胰蛋白酶的恒溫（32℃
2、）ACSF內(nèi)酶解30min，以正常充氧的ACSF沖洗2～3遍，然后將腦片移入充氧的含0.05%蛋白酶E的恒溫（32℃）ACSF內(nèi)酶解30min，以正常充氧的ACSF沖洗2～3遍，即可將腦片置于室溫充氧的ACSF中保存。在開始膜片鉗實驗前，取1～2片腦片移入2mlACSF中，以火拋光的Pasteur吸管（500、300、150μm）順序吹打，靜置10min，取上清經(jīng)金屬網(wǎng)過濾加入細胞池內(nèi)，靜置15～20min，于顯微鏡下可見大量的單個海馬錐體神經(jīng)元。1.3膜片鉗全細胞模式記錄以臺氏液〔成分（mmol/L）：氯化膽
3、堿120,KCl6,MgCl210,葡萄糖20,HEPES10,以KOH調(diào)節(jié)pH至7.30〕灌流分離好的細胞，流速1.5ml/min。玻璃微電極（原料GG17，外徑1.5mm，中國科學(xué)院上海腦研究所提供）由PP-83型拉制儀（日本Narishige公司）分兩步拉制，充灌電極內(nèi)液〔成分（mmol/L）：KCl140，MgCl20.5，EGTA10，HEPES10，以KOH調(diào)節(jié)pH至7.20〕后電阻為4～5MΩ。選擇細胞表面光滑、細胞內(nèi)無顆粒、無空泡的健康錐體細胞，采用高阻封接技術(shù)，負壓破膜，形成全細胞記錄。EPC
4、-9型膜片鉗放大器（德國HEKA公司）通過ITC-16連接IBM微型計算機，應(yīng)用PULSE程序進行刺激發(fā)放和信號采集，結(jié)果存于計算機內(nèi)，以備分析。1.4電流記錄和分析方法破膜后細胞膜電位鉗制在-50mV，首先超極化至-110mV，持續(xù)150ms，然后除極到-50mV，持續(xù)50ms，隨后以步長10mV的階躍刺激從-50mV至+40mV除極150ms，測量每次階躍除極刺激末端（150ms）處的電流，即為IK電流。采用GPIP軟件，以Boltzmann方程擬合穩(wěn)態(tài)激活曲線：G/Gmax=1/{1+exp［-（V-V1
5、/2）/k］}，其中G/Gmax是通道的電導(dǎo)百分?jǐn)?shù)，V為去極化膜電位，V1/2是半數(shù)最大激活膜電位，k為斜率因子。1.5給藥系統(tǒng)采用美國ALA公司的BPS-4灌流系統(tǒng)給藥，控制流速為1～1.5ml/min，灌流液溫度維持在室溫（22～24℃）。ACSF、臺氏液及藥物均在實驗當(dāng)天配制。其中四乙銨（TEA）、4-氨基吡啶（4-AP）、胰蛋白酶、蛋白酶E、HEPES、EGTA為Sigma公司產(chǎn)品，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。1.6統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均以±s表示，采用兩樣本均數(shù)的t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理，P0.05為差異有顯著
6、性。2結(jié)果2.1IK電流的記錄及發(fā)育變化采用氯化膽堿完全取代灌流液中的Na+，以排除Na+電流的干擾。在所研究的3組動物海馬錐體細胞中，均可記錄到IK電流。圖１顯示發(fā)育過程中IK電流幅度的變化。當(dāng)除極到+30mV時，3個年齡組海馬IK峰值電流密度、電流幅度及細胞膜電容的變化見表１，可見隨年齡增大，IK電流幅度及密度均上調(diào)，而P25-30和P56-602組間未見顯著性改變。2.2IK電流的激活動力學(xué)變化根據(jù)所記錄到的IK電流，研究了出生后發(fā)育過程中海馬錐體神經(jīng)元IK電流的穩(wěn)態(tài)激活動力學(xué)的變化，結(jié)果表明隨年齡增大，
7、IK的穩(wěn)態(tài)激活曲線左移，其半數(shù)最大激活電位（V1/2）由-12.2mV逐漸增加到-17.8mV，而斜率因子基本不變（圖2、表2）。不同年齡組的V1/2和k值比較見表2。2.3IK電流藥理學(xué)特征的變化利用鉀電流對TEA和4-AP敏感性的不同可以區(qū)分不同亞型的電壓依賴性鉀通道。我們研究了3個年齡組海馬錐體神經(jīng)元IK對不同濃度TEA和4-AP的敏感性，以探討在發(fā)育過程中是否有鉀通道亞型的變化。圖3顯示TEA可劑量依賴性地抑制P7-10、P25-30、P56-603個年齡組的IK，其中P7-10組的IK對低濃度的TEA
8、（2和5mmol/L）較P25-30及P56-60組更敏感，而20mmol/L的TEA對3個年齡組動物的IK抑制百分率基本一致,均可抑制約60%。4-AP也可抑制IK，但未見劑量依賴性，1mmol/L的4-AP對3組動物所記錄的IK均可抑制約20%；而2及5mmol/L的4-AP對IK電流抑制效應(yīng)無明顯增強（圖4）。表1不同年齡組大鼠海馬神經(jīng)元IK電流密度的變化表2不同年齡組大鼠海馬神
