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1、大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外可誘導(dǎo)分化為角膜上皮細胞論文姜廷帥蔡莉惠延年閆峰AbstractAIM:Toexploretheplasticityoftransdifferentiationofmesenchymalstemcells(MSC)intocornealepithelialcells.METHODS:MSCofadultratsthatentculturemethod.ThetransdifferentiationofMSCintocornealepithelialcellsalfibro
2、blasts.TheexpressionofK12onMSCsmunofluorescentstaining.RESULTS:MSCculturedinvitroshoalfibroblastsforoneesenchymalstemcell;cornealepithelialcells;transdifferentiation摘要目的:探討骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymalstemcell，MSC）分化為角膜上皮細胞的可塑性及其重建角膜上皮的可能性。方法:用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分
3、離純化大鼠骨髓MSC，經(jīng)體外與角膜基質(zhì)細胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化，免疫熒光法檢測角膜上皮細胞特異標志物K12的表達。結(jié)果:體外培養(yǎng)的大鼠骨髓MSC表現(xiàn)出很強的增殖潛能，原代培養(yǎng)的骨髓MSCCD29免疫熒光染色陽性，CD34和CD45為陰性，符合骨髓MSC的特征。MSC與角膜基質(zhì)細胞共培養(yǎng)1esenchymalstemcell，MSC），在體外不同條件下可以定向地被誘導(dǎo)分化為心肌細胞、脂肪細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞、骨、軟骨、肌腱及骨髓基質(zhì)等不同細胞。我們對骨髓MSC向角膜上皮細胞的分化潛能做一些
4、初步的探索，從而探討骨髓MSC作為構(gòu)建組織工程化角膜的種子細胞的可行性。1材料和方法1.1材料PBS液(含青鏈霉素100kU/L)；細胞培養(yǎng)基(DMEM/Ham’sF12,10mL/L胎牛血清)；2.5g/L胰蛋白酶；中性蛋白酶dispaseⅡ；Percoll儲存液（密度1077g/L）；兔抗大鼠CD29，CD34，CD45mAb（美國Chemicon公司）、兔抗大鼠角蛋白K12mAb（美國SantaCruz公司），山羊抗兔FITC標記二抗（北京中山生物技術(shù)公司），跨室培養(yǎng)裝置（Trans，美國
5、Millipore公司）。1.2方法1.2.1大鼠骨髓MSC的分離培養(yǎng)取4L/L乙醇中浸泡10min。無菌條件下用外科剪于大鼠的股骨端將大腿剪下，剪去脛骨，用眼科剪剪開皮膚，分離去除肌肉，剪去股骨兩端的膨隆部分，暴露骨髓腔，用含肝素的PBS液沖洗骨髓腔，收集于培養(yǎng)皿，如此反復(fù)數(shù)次。在一無菌離心管中，加入Percoll液0.6mL和8.5g/LNaCl溶液0.4mL，混勻配制成密度為1077g/L的細胞密度梯度分離液。將收集的細胞懸液緩慢加在分離液的上部，2000r/min離心30min，去除上清
6、。PBS洗2次，按2×108/L密度接種細胞于75mL塑料培養(yǎng)瓶中。接種48h后換液，以后每2～3d換液，觀察細胞增殖能力及形態(tài)學(xué)特征（倒置顯微鏡）。另將原代培養(yǎng)的MSC接種于蓋玻片上，待細胞長出后，用PBS離心洗滌（1000r/min，5min）2次，把細胞片浸入950mL/L乙醇中固定。將已經(jīng)固定的細胞玻片放入蓋片染色缸，用PBS振洗5min，取出吹干。滴加滴度為1∶32～64的特異性抗體(一抗，CD29，CD34，CD45，K12)，置于濕盒內(nèi)，37℃保溫孵育60min，另以PBS代替一抗
7、作陰性對照。隨后PBS振洗3次，吹干。滴加適當稀釋的熒光素標記抗體（二抗，F(xiàn)ITC標記的山羊抗兔IgG），置于濕盒內(nèi)，37℃保溫30min。PBS振洗2次，然后用蒸餾水振洗1次。500mL/L緩沖甘油封片。在熒光顯微鏡下觀察并照相記錄。1.2.2角膜基質(zhì)細胞的制備無菌條件下摘取大鼠眼球，沿角膜緣處分離出整個角膜，先用普通消化液浸泡，置于37℃30min，再用dispaseⅡ于37℃消化2～3h。消化后用PBS洗去消化下來的上皮細胞。在顯微鏡下觀察，若發(fā)現(xiàn)細胞未消化干凈，用眼科小鑷子輕輕刮取細胞，
8、確保角膜上皮細胞完全被消化下來。將角膜基質(zhì)剪成1mm×1mm大小的組織塊，放入離心管中加入4mL膠原酶，將離心管傾斜放入37℃孵箱內(nèi)，每隔5min振搖一次，消化1h。收集消化液，過100目不銹鋼網(wǎng)過濾，800r/min離心，5min，去除上清，用PBS離心漂洗1～2次，去除上清，按1×107/L密度接種于25mL培養(yǎng)瓶中。1.2.3大鼠骨髓MSC與角膜基質(zhì)細胞共培養(yǎng)按Millipore公司的說明，用Trans）裝置進行大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞與角膜基質(zhì)細胞的共培養(yǎng)。共培養(yǎng)體系中上、下層的細胞被隔開，
