d大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離

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1、SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的實驗研究第一組：演講人：實驗?zāi)康模航⒁环N簡便有效的體外分離純化及培養(yǎng)擴增大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的方法，研究BMSCs的生物學(xué)特性，為后續(xù)細(xì)胞移植和基因治療提供理想的種子細(xì)胞。實驗結(jié)果：大鼠BMSCs體外培養(yǎng)生長狀況良好，可見BMSCs呈均一的梭形和多角形。流式細(xì)胞儀檢測顯示BMSCs表達(dá)CD29、CD90，不表達(dá)CD34、CD45。經(jīng)體外誘導(dǎo)后具有多向分化潛能。試驗方法：全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離大鼠BMSCs，體外培養(yǎng)和連續(xù)傳代，在倒置相差顯微鏡下連續(xù)觀察

2、細(xì)胞的形態(tài)變化，利用MTT法測定其生長曲線，流式細(xì)胞儀鑒定其表面抗原，成骨、成脂肪誘導(dǎo)分化鑒定其多向分化潛能。結(jié)論：全骨髓貼壁培養(yǎng)法適合體外分離、擴增和純化大鼠BMSCs，培養(yǎng)的大鼠BMSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞的一般生物學(xué)特性，為后續(xù)基因修飾BMSCs及其體內(nèi)移植實驗奠定良好的基礎(chǔ)。實驗材料：6~8周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量80~100g，清潔級，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司[許可證號為SC-XK(滬)20082-005]。胎牛血清(美國Hyclone公司)，L-DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，

3、胰酶(美國Gibco公司)，CD34-FITC抗體、CD45-FITC抗體、CD90-FITC抗體(英國AbDSerotec公司)，CD29-FITC抗體(美國Biolegend公司)前言：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells，BMSCs)作為一種組織特異性干細(xì)胞，具有高度增殖能力和多向分化潛能，其作為種子細(xì)胞在干細(xì)胞移植和基因治療等方面的研究倍受關(guān)注。2007年9月至2008年8月我們開展了體外分離純化及培養(yǎng)擴增大鼠BMSCs的實驗，為進(jìn)行基因

4、修飾BMSCs及其體內(nèi)移植的后續(xù)實驗奠定良好的基礎(chǔ)。試驗方法：1、鼠原代BMSCs的分離培養(yǎng)抽取10%水合氯醛0.2ml腹腔注射麻醉大鼠后，用75%酒精浸泡大鼠雙下肢5min，無菌條件下分離出大鼠雙側(cè)的股骨和脛骨，將離體的骨干放入滅菌PBS緩沖液中沖洗后轉(zhuǎn)入含10%胎牛血清的低糖型DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。剪去兩側(cè)干骺端，暴露骨髓腔，用無菌注射器抽取5ml含10%胎牛血清的低糖型DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，直至骨髓腔內(nèi)所有骨髓液沖凈。反復(fù)吹打骨髓沖洗液制成單細(xì)胞懸液，將此懸液接種于25cm2的塑料培養(yǎng)

5、瓶中，置于37℃、5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。3d后首次換液，以后每3d換液1次。倒置顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞形態(tài)。2、大鼠BMSCs的傳代與純化通過全骨髓貼壁培養(yǎng)法，每次換液棄除懸浮細(xì)胞。貼壁細(xì)胞主要是BMSCs，但可能混有淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等造血細(xì)胞，7~10d原代細(xì)胞生長融合達(dá)80%~90%，以0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)-胰酶消化后按1:2的比例傳代培養(yǎng)。原代細(xì)胞傳代后的細(xì)胞標(biāo)記為P1(Passage1)，反復(fù)傳代擴增，并依次遞增標(biāo)記。每次傳代時用0.25%EDTA-胰蛋白酶(0.04ml

6、/cm2)消化1~2min，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM完全培養(yǎng)基終止消化。嚴(yán)格控制胰酶的用量和消化時間，利用BMSCs較易脫落的特點，保證BMSCs在較短的時間內(nèi)與培養(yǎng)瓶底分開，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞則因貼壁性強仍貼附于培養(yǎng)瓶底，從而使BMSCs得到純化。大鼠BMSCs生長曲線測定：為了定量測定大鼠BMSCs的生長狀況，對來源于同一動物的原代細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，分別選取生長良好的P1、P3、P5代BMSCs消化后制備成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/ml。接種于96孔板，每孔接種200μl細(xì)胞懸液

7、進(jìn)行培養(yǎng)(每孔1×104細(xì)胞)。次日起每天選擇6個培養(yǎng)孔各自加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，37℃繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng)，吸出孔內(nèi)上清，每孔加入150μl二甲基亞砜(DMSO)，室溫振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。與實驗孔平行設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照1孔。在酶標(biāo)儀上選擇570nm波長，以空白孔調(diào)零，測定各孔吸光度(A)值，連續(xù)測7d，以時間為橫軸，A值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。2、大鼠BMSCsP4細(xì)胞成骨、成脂誘導(dǎo)分化鑒定(1)向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化：待培養(yǎng)的BMSCsP3細(xì)胞生長至80%~9

8、0%的融合，加入0.25%EDTA-胰酶消化后，以2×104/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)1d后，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)組(實驗組)加入2ml成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液，基礎(chǔ)培養(yǎng)組(對照組)加入等量基礎(chǔ)培養(yǎng)液，每3d換液1次。成骨誘導(dǎo)21d后，進(jìn)行茜素紅染色檢測，確定細(xì)胞外基質(zhì)的礦化。(2)茜素紅染色：兩組細(xì)胞分別用PBS沖洗2次，95%乙醇固定5min，茜素紅染液染色5min，蒸餾水沖洗3次，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和染色結(jié)果。(3)向成脂肪細(xì)