大鼠骨髓間充質干細胞分離培養(yǎng)及鑒定

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萬方數據醫(yī)學研究雜志2013年5月第42卷第5期·論善·————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————一一大鼠骨髓間充質干細胞分離培養(yǎng)及鑒定姚燦郟舜杰陳海嘯洪盾朱敏范厲龍呂海燕摘要目的建立一套簡單易行有效的骨髓間充質干細胞(BMscs)的培養(yǎng)、純化、鑒定的方案，初步了解BMSCs的基本性狀和功能特點。方法取4周齡雄性sD大鼠，全骨髓貼壁培養(yǎng)BMscs，對細胞相關的性狀進行觀察及分析，流式鑒定表面抗原，誘導其成骨、成脂分化，并進行染色鑒定等。結果流式檢測結果cD29、cD90呈陽性反應，cD34、cD45呈陰性反應，成骨誘導分化后茜素紅染色呈陽性反應，成脂誘導分化后油紅染色呈陽性反應。結論全骨髓培養(yǎng)法是一種相對簡單易行的BMSCs分離純化的方法，可獲得純度高，活性好，性狀均～的BMScs。關鍵詞骨髓間充質干細胞原代培養(yǎng)分化s鑒定Isolation。cultureandldentificationofBoneMesenchymaIstemcellsofsDRatsinvitro．y口oCn凡，，iⅡJs^u強一e，C矗enHo血ido，^ro，tgDMn，e￡口f．7h如^ouHospi￡Ⅱf／坳fio￡ed￡DIF0，lz^ou肘ed站ozCoZZ89e，Z^E一口，蟛，J7DD0，c^i凡oAbstractObjectiveToestablishanefkctivemethodtocultivateandidentifyBMSCs，andtohaveapreliminaryunderstandingofthecharacteris“csoftheBMSCs．MethodsRatbonemarrowmesenchymalstemcellsoffourweeksoldSprague—Dawleywereinvitroi—solatedbywholebonemarrowadherencemethod．Cellmorphologywasobsenred，andexpressionsofCD34，CD45，CD29，CD90cellfactorswereexaminedbyflowcyt。metryanddifferentiationabilitywasdetectedt。identifywhetherit’stheBMSCs．ResultsCellsappearedspindle—shapedandshowedcharacteris“cswirlinggrowth．ThesuIfacemarkerCD34，CD45werenegative，CD90，CD29werepositive．After0steogenicandAdipogenicdifferentiation，Alizarinredand0ilRedstainingwaspositive．ConclusionWesuccessfullyIsoIatedthebonemarrowmesenchymalstemcells(BMSCs)bythewholebonemarrowculturemethod，andfoundthatcellshadh培hpurityandgoodactivitywithin8thgeneration．Thewholebonemarrowculturewaseffctiveandeasy．KeywordsBMSC；P“maryculture；Differentiation；ldentifica“on骨髓間充質干細胞(BMSCs)是起源于骨髓支持結構的一群成體干細胞，具有自我更新、多向分化潛能。BMSCs在不同的誘導環(huán)境中可分化為骨細胞、成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞、肌肉細胞、肝細胞樣細胞、脂肪細胞等多種組織細胞，且BM．scs具有低免疫原性，成為組織工程首選種子細胞‘1’“。本研究應用全骨髓貼壁法，利用該細胞的黏附特性，貼壁分離BMSCs，傳代并鑒定，建立一種較為簡單、有效的BMsCs的培養(yǎng)方法，為本項目的進一步研究打下良好的基礎。材料與方法1．材料：(1)實驗動物：4周齡雌性SPF級sD大鼠(購于浙江省醫(yī)學科學院)。(2)實驗試劑：75％乙醇、PBs(Hy—e10ne)、MEM一儀培養(yǎng)基(Gibco)、胎牛血清(Hyclone)、胰蛋白酶(Gibco)、成骨誘導液(cYAGEN)、成脂誘導液(cYAGEN)、CD29(BD)、CD45(BD)、cD90(BD)、cD34(santacruz)、MTS(Promega)。(3)實驗設備：無菌手術器械，移液器(Eppen．基金項目：國家自然科學基金資助項目(81171748)作者單位：317000臨海，溫州醫(yī)學院附屬臺州醫(yī)院dorf)，生物潔凈工作臺(蘇凈安泰)，離心機(湘儀)，4℃及一20℃s冰箱(海爾集團)，細胞培養(yǎng)箱(Thermoscientific)，倒置相差熒光顯微鏡(Leica)，RT6000酶標分析儀(Rayt0)，流式細胞儀(BDFAcscalibur)，一80℃超低溫冰箱(Thermoscien—tific)，純水儀(HealForce)，蒸發(fā)滅菌器(上海博訊)，電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)，0．22斗m濾器(Millj—pore)，25cm2細胞培養(yǎng)瓶(Corning)，細胞培養(yǎng)板(corni“g)，離心管(corning)。2．方法：(1)BMsCs分離培養(yǎng)：取sD大鼠1只，頸椎脫臼法處死，浸泡于75％乙醇中約5一10min，無菌手術器械取出雙側股骨及脛骨，去除附著肌肉，將其浸泡于適量培養(yǎng)基中。取10ml針筒，在股骨及脛骨兩端打各打2～3個孔，針筒吸取適量培養(yǎng)基插入一端干骺端，將骨髓中細胞沖至培養(yǎng)皿中，反復幾次，直至股骨及脛骨發(fā)白，收集此細胞懸液，用200目金屬濾網過濾去除稍大的雜質，將過濾后緬胞懸液收集至離心管中，800r／min，5min離心，棄上清，加人適量d—MEM培養(yǎng)基混勻，接種于兩個25cm2塑料培養(yǎng)瓶中，于37℃，體積分數5％c0：飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)48—72h后全量更換培養(yǎng)基，注意動作輕柔，此后每隔3天全量更換培養(yǎng)基1次。(2)BM·scs傳代培養(yǎng)：約于9～12天后形成多個細胞集落，長滿瓶底約70％～80％后可用0．125％胰酶消化，l：2傳代培養(yǎng)?！?7． 萬方數據·論善·JMedRes，May2013，V01．42No．53．細胞生物學特性：(1)細胞形態(tài)觀察：將不同代數的BMSCs接種于培養(yǎng)瓶中，每日用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)改變，并拍照記錄。(2)繪制細胞生長曲線：分別將生長狀態(tài)良好的第2、3、4代(以下簡寫成P2、P3、P4)BMscs以3×104／孔接種于24孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24h各消化3孔，計數板上顯微鏡下計數，記錄數值，l周后統計數據并以時間為橫軸，細胞計數為縱軸制圖。(3)細胞活性測定：取生長狀態(tài)良好的P2一P8BMSCs，以1x104／孑L的密度接種于96孔板中，每孔100¨l，培養(yǎng)3天后，加入MTs，孵育2h后置于酶標分析儀檢測490nm處吸光度值，記錄數據并制圖。4．BMSCs的鑒定：(1)流式表面標記鑒定：胰酶消化P4代BMScs，用PBs清洗3遍，計數細胞，重懸細胞后送至流式實驗室檢測表面標記cD34、cD29、CD45、cD90表達情況。(2)成骨分化能力鑒定：選擇P3代細胞以1．5×105／孔的密度接種于六孔板中，選用Cyagen公司SD大鼠專用成骨誘導液，每隔3天全量更換誘導液，培養(yǎng)21天后進行茜素紅染色，觀察結果并拍照。(3)成脂分化能力鑒定：選擇P3代細胞以1．5×105／孔的密度接種于六孔板中，選用Cyagen公司SD大鼠專用成脂誘導液，選用A液培養(yǎng)3天后改用B液培養(yǎng)24h，重復上述操作3次，然后以B液培養(yǎng)細胞6天，最后進行油紅染色，觀察結果并拍照。結果1．BMSCs形態(tài)：將骨髓細胞接種于培養(yǎng)瓶24h后，可見大量細胞懸浮，多數是紅細胞，部分細胞貼壁，此時可觀察到少量貼壁的BMSCs聚集成堆，形態(tài)不典型，成多角形(圖1A呈不規(guī)則形，貼壁的為BM—sCs)。3天后全量更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，約培養(yǎng)4～6天后可見貼壁細胞質開始舒展，呈梭形(圖1B)。約9～12天后，BMScs細胞較為典型，呈梭形、網狀，聚集生長(圖lC)。j：≥：鬻蓉u口妙夕。尸_0’氣≯雹6■J▲，。V§、一’．d艫j}B_圖1不同培養(yǎng)和時間細胞形態(tài)觀察A．原代培養(yǎng)24小時；B．原代培養(yǎng)3天；C．原代培養(yǎng)9天2．P2～P4代BMSCs生長曲線(圖2)：P2～P4細胞接種最初的1—2天內細胞增殖緩慢，為潛伏期，3—6天進入快速增殖期，此后細胞密度顯著增加，可能是由于接觸抑制的原因導致增殖再次明顯減慢，進入平臺期。從圖中也可發(fā)現隨著代數增加其快速增長期的增長速度依次略有提高，這可能與后期細胞純度增加有一定的關系。已60()()(1粵4()(】00輜捌崩20()oO0l?司(大)圖2P2一P4代BMSCs生長曲線3．P2．P8代BMSCs的活性比較(圖3)：所測數據經統計學分析，多樣本均數間兩兩比較的9檢驗，·68·P>0．05，無統計學意義，即此次試驗數據表明，P2一P8代BMsCs活性無明顯差異。這對于試驗具有一定指導意義。：。cS趔世蕓昏2．O0．0絀JJf!!代數圖3P2一P6代BMsCs細胞活性4．P4代BMSCs流式檢測結果(圖4)：CD29陽性率>99％，CD90陽性率>95％，CD45陽性率