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《分離培養(yǎng)及鑒定骨髓間充質(zhì)干細胞的方法探析》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、分離培養(yǎng)及鑒定骨髓間充質(zhì)干細胞的方法探析 目前，骨髓間充質(zhì)干細胞在動物實驗和臨床應用上取得了巨大的成果，下面是小編搜集整理的一篇探究分離培養(yǎng)及鑒定骨髓間充質(zhì)干細胞方法的論文范文，供大家閱讀參考。 骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)也被稱為間質(zhì)祖細胞，由于其巨大的增殖和多向分化潛能，被認為是再生醫(yī)學、基因治療和細胞治療的理想種子來源，已被廣泛進行研究[1-3].目前，BMSCs在動物實驗和臨床應用上取得了巨大的成果，在骨、軟骨、肌腱、神經(jīng)膠質(zhì)修復、心臟疾病、心肌梗塞、肝臟損傷等方面取得了重大突破[4-6],并且可避免胚胎干細胞和異基因干細胞治療
2、所涉及的倫理道德和免疫排斥問題，有利于細胞移植。但是骨髓中的BMSCs含量極少，約占骨髓全細胞的0.001%~0.010%[7];因此，需要在體外分離純化、培養(yǎng)擴增來滿足臨床應用和實驗研究。研究表明，不同分離方法和首次換液方式對BMSCs的增殖培養(yǎng)有很大的影響[8].本試驗通過觀察2種不同分離方法和不同首次換液時間對兔BMSCs生物活性的影響，旨在建立一種有效的分離培養(yǎng)及鑒定BMSCs的方法，以便獲得大量、高純度、高活性、培養(yǎng)周期短的BMSCs,為下一步研究和臨床實驗提供基礎?！ ?材料與方法 1.1實驗動物1月齡雄性新西蘭大耳白兔1只，由
3、河南省實驗動物中心提供。 1.2主要試劑和儀器胎牛血清(北京四季青);DMEM-F12(Gibco);胰蛋白酶(北京拜爾迪生物公司);DMSO(Gibco);紅細胞裂解液(北京賽馳生物技術有限公司);生物素標記山羊抗兔IgG、HRP標記鏈霉親和素、DAB顯色試劑盒、改良型蘇木素(北京華肽先鋒);兔抗兔CD34、CD44、CD99抗體(北京博奧森);封閉山羊血清(北京博奧森)?！ F151UV型CO2培養(yǎng)箱(HealForce);倒置顯微鏡(Leica);800型離心機、85-2恒溫磁力攪拌器：金壇市大地自動化儀器廠;數(shù)碼相機：日本佳能IX
4、US980IS;電子天平：METTLERTOLEDOAL104;超凈工作臺：AIRTECH;FX101-2型電熱鼓風干燥箱：上海樹立儀器儀表有限公司;pH計：上海雷磁儀器廠?！ ?.3BMSCs的提取用陸眠寧(846)將1月齡新西蘭大耳白兔麻醉，腿部去毛消毒，無菌條件下分離股骨、脛骨，剔除脂肪和肌肉，PBS液反復沖洗，剪斷兩側干骺端，盡量多保留干骺端，DMEM-F12培養(yǎng)液反復沖洗骨髓腔于A、B兩個10mL的離心管內(nèi)，直至骨髓腔發(fā)白，1000r/min離心5min,棄上清?！ ?.4全骨髓貼壁法A管用PBS重懸細胞，1000r/min離心5m
5、in洗滌2次，棄上清。吸取3mL含10%FBS的DMEM-F12(1∶100雙抗)培養(yǎng)液重懸細胞，接種至3個25cm2培養(yǎng)瓶，補足培養(yǎng)液至5mL,輕柔吹打均勻。置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。以后每3d換液1次，待細胞生長融合至80%時傳代培養(yǎng)。先棄去舊培養(yǎng)液，PBS液浸洗。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA,37℃條件下孵育3min,含血清的DMEM-F12終止消化。以1∶2的比例傳代培養(yǎng)，每3d換液1次。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。 1.5紅細胞裂解法B管加入1mL紅細胞裂解液重懸細胞，靜置1~3min,待液體由紅色變?yōu)榘咨?/p>
6、，加入5mLPBS液，1000r/min離心2次，5min/次，棄上清。吸取3mL含10%FBS的DMEM-F12(1∶100雙抗)培養(yǎng)液重懸細胞，接種至3個25cm2培養(yǎng)瓶，補足培養(yǎng)液至5mL,輕柔吹打均勻。置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。 2d后首次換液，以后每3d換液1次，待細胞生長融合至80%時傳代培養(yǎng)。先棄去舊培養(yǎng)液，PBS液浸洗。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA,37℃條件下孵育3min,含血清的DMEM-F12終止消化。以1∶2的比例傳代培養(yǎng)，每3d換液1次。每天倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)?！ ?.6兔BMSCs細胞活性
7、檢測及生長曲線繪制培養(yǎng)48h時，各取一瓶細胞，棄去培養(yǎng)基，用PBS沖洗2遍，倒置顯微鏡下觀察細胞。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化后，0.4%臺盼藍染色，血球計數(shù)板計數(shù)活細胞(未著色)和死細胞(著色細胞)。分別計算出2種不同分離方法的細胞活性。上述試驗重復3次?！ ∵x取生長良好的P1、P3和P8代細胞，以2.0104個/孔，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1mL,每3d換液1次，每隔1d取3孔，消化后計數(shù)，取其平均值為當天的細胞數(shù)，連測8d,以培養(yǎng)時間為橫坐標，細胞數(shù)為縱坐標，繪制細胞生長曲線?！ ?.7首次換液時間對兔BMSCs的影響將
8、用紅細胞裂解法分離得到的兔BMSCs按首次換液時間隨機分為4組：12h換液組、24h換液組、48h換液組、72h換液組，以后每3d換液1次，記錄傳代前各組0~3代各
