山羊骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定

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1、山羊骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定【摘要】目的分離培養(yǎng)山羊的間充質(zhì)干細胞，并為其在骨組織工程研究中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。方法應(yīng)用常規(guī)的密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法從山羊骨髓中分離間充質(zhì)干細胞，并通過觀察分離培養(yǎng)細胞的形態(tài)，檢測其表面的CD分子表達，以及RTPCR和免疫組化病理染色方法證實成骨、成軟骨、成脂肪多方向分化潛能來對細胞進行鑒定。結(jié)果分離的細胞具有成纖維細胞樣形態(tài)，第三代細胞的表面分子CD29和CD44陽性率為98.70%、99.54%，而CD62L和CD45陽性率為1.10%和0.73%。RTPCR和免疫組化病理染色證實分離細胞具有成骨、成軟骨、成脂肪多方向分化潛能。結(jié)論

2、成功地分離培養(yǎng)山羊的骨髓間充質(zhì)干細胞，使山羊間充質(zhì)干細胞應(yīng)用于骨組織工程的研究成為可能。【關(guān)鍵詞】骨組織工程；山羊；骨髓間充質(zhì)干細胞；鑒定Abstract:ObjectiveToisolateandculturegoatmesenchymalstemcells(MSCs)frombonemarrow,andexploretheirapplicationinbonetissueengineering.MethodsCellswereisolatedfromgoatbonemarrowbyconventionalmethods.Theidentificationofcellwasmad

3、ebycellmorphous,expressionofcellepitopeprofile,andmultilineagedifferentiationofosteogenesis,chondrogenesis,andadipogenesisassayedRTPCRandimmunohistologystaining.ResultsThecellswerefibroblast11like,whosepositiverateofCD29andCD44were98.70%and99.54%，andthepercentageofCD62LandCD45were1.10%and0.7

4、3%.TheresultsofRTPCRandimmunohistologystainingshowedmultilineagedifferentiationpotentialofcell.ConclusionMSCsweresuccessfullyisolatedfromgoatbonemarrowanditispossiblethattheywillbeusedintheresearchfieldofbonetissueengineering.Keywords:bonetissueengineering;goat;bonemarrowmesenchymalstemcells;

5、identification間充質(zhì)干細胞（mesenchymalstemcells，MSCs）是多潛能干細胞，具有向骨、軟骨、脂肪等組織分化的能力［1］。目前研究發(fā)現(xiàn)其來源廣泛，存在于骨髓組織、脂肪組織和臍血中等［24］。來源于骨髓組織中的MSCs具有增殖快、誘導(dǎo)成骨能力較強特點，因而成為目前骨組織工程中重要的種子細胞來源，其與支架材料復(fù)合后移植體內(nèi)能明顯改善骨缺損的修復(fù)［5］。本實驗對來源于山羊骨髓組織的MSCs進行分離、純化和鑒定，為將其應(yīng)用于組織工程骨相關(guān)實驗研究奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1.1MSCs的純化與培養(yǎng)11抽取體重為25kg雄性山羊（由第三軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供）髂骨

6、骨髓10mL，等量稀釋后加入到含有等體積的密度為1.07g/mL的Percoll（Amresco）分離液的離心管中，以3000r/min離心20min，吸取中間乳白色云霧狀有核細胞層，漂洗后加入DMEM/F12培養(yǎng)基（Hyclone）和體積比10%的胎牛血清（Hyclone），制成單細胞懸液，以2×106/cm2的細胞密度接種培養(yǎng)瓶，3d后首次全量換液，棄去大量懸浮細胞，以后根據(jù)培養(yǎng)基的顏色，每2～3d換液。待細胞長滿單層后，用含有0.25%胰酶的EDTA溶液（0.01%，w/v）消化傳代。1.2表面分子鑒定取傳3代后的貼壁細胞，PBS溶液洗3次，用含有0.25%胰酶的EDTA溶

7、液（0.01%，w/v）消化制成單細胞懸液，計數(shù)后制備流式細胞儀上機樣品。其中一抗為CD29、CD60L和CD45（均購自VMRD，小鼠單克隆抗體，1mg/mL），CD44（購自Abcam，大鼠單克隆抗體，1mg/mL）；二抗為FITC（購自SouthernBiotech，兔抗大鼠，1mg/mL）和PE（購自生物晶美，羊抗小鼠）。同上方法取第一代至第三代的MSCs進行CD29和CD44雙染。1.3體外分化111.3.1成骨分化取傳3代后的MSCs接種后，用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)