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《小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)與鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)與鑒定林蕓1蔡鵬威2陳為民1孟春3（1福建醫(yī)科大學(xué)省立醫(yī)院臨床學(xué)院血液科福建福州350001）（2福建省立醫(yī)院檢驗科福建福州350001）（3福州大學(xué)生物工程學(xué)院福建福州350001）【摘要】目的分離、培養(yǎng)符合實驗要求的小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞并進行鑒定，為進一步的研究打基礎(chǔ)。方法采用貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，觀察細胞的形態(tài)及生長特性，并應(yīng)用流式細胞儀對細胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44進行表型鑒定。結(jié)果原代分離的間充質(zhì)干細胞在接種后培養(yǎng)24小時，細胞開始貼壁
2、，胞體呈圓形或多邊形，培養(yǎng)第3-5天，細胞幵始較緊密貼附壁上并開始有細胞呈梭形，培養(yǎng)第7天開始觀察到細胞分裂，隨著細胞數(shù)的增加，細胞的牛.長速度變快,逐漸成漩渦狀排列，培養(yǎng)第12天貼壁細胞長滿瓶底的80%,并融合成片。傳代后細胞生長迅速，培養(yǎng)7天左右即可訟滿瓶底的80%。傳至10代仍異有良好的增殖活性。流式細胞儀檢測第4代及第8代MSCs細胞均不表達CD34、CD45,但表達CD29、CD44,純度分別為73.8%、91.65%。結(jié)論采用貼壁培養(yǎng)法可獲得生長狀態(tài)良好、增殖能力強的間充質(zhì)干細胞，隨傳代數(shù)增加，其純
3、度增加，且該方法簡單、實用。【關(guān)鍵詞】骨髓間充質(zhì)干細胞細胞培養(yǎng)流式細胞術(shù)表型鑒定【中圖分類號】R392.2【文獻標識碼】A【文章編號】2095-1752（2012）01-0082-02間充質(zhì)干細胞（mesenchymalstemcells,MSCs）起源于中胚層，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、軟骨、脂肪、血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)星型膠質(zhì)細胞等分化的潛能［1］，可分化成骨髓基質(zhì)支持造血，并可分泌多種細胞因子促進造血干細胞增殖分化，同時它能抑制同種異體反應(yīng)性T淋巴細胞，在同種異基因造血干細胞移植后的造血重建及免疫
4、調(diào)節(jié)，預(yù)防移植物抗宿主病等方面有廣闊的應(yīng)用前景［2］,但骨髓間充質(zhì)干細胞含量極低，僅占骨髓單個核細胞的0.001%-0.010%[3],因此，培養(yǎng)出生長狀態(tài)良好，足夠數(shù)量的骨髓間充質(zhì)干細胞是應(yīng)用的前提。1材料和方法1.1材料1.1.1實驗動物雄性，C57BL/6小鼠，清潔級，8周齡，體重18-20g,購于吳氏動物實驗中心。1.1.2實驗儀器與試劑低糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），特級胎牛血清（Hyclone公司），胰蛋白酶（Sigma公司），青霉素鈉（Sigma公司），鏈霉素（Sigma公司）,5%C02培
5、養(yǎng)箱（曰本三洋公司），流式細胞儀（BDFACSCalibur）,倒置顯微鏡（OLYMPUS）,大鼠抗小鼠單克隆抗體：CD29-PE、CD44-FITC、CD34-PE、CD45-FITC（BD公司）。1.2方法1.2.1小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離及原代培養(yǎng)取8周齡雄性C57BL/6小鼠，頸椎脫臼法處死，75%灑精浸泡5分鐘，取出雙側(cè)腿骨，置于裝有PBS溶液的培養(yǎng)皿中小心剔除粘連于骨上的肌閃組織，移入裝冇預(yù)冷的含10%特級胎牛血清、青霉素鈉100U/ml、鏈霉素O.lg八的低糖DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，剪去腿骨兩
6、端，用lm丨注射器抽取培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，直至骨發(fā)白，收集沖洗液，反復(fù)吹打使細胞打散，靜置10分鐘，小心將上清移至火菌的10ml離心管中，4°C3000rpm離心3分鐘，棄上清，用含10%特級胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，反復(fù)吹打混勻，4°C3000rpm離心3分鐘，棄上清，再用含10%特級胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，反復(fù)吹打混勻，4°C3000rpm離心3分鐘，棄上清，再用含10%特級胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，反復(fù)吹打混勻，調(diào)整細胞密度為5×105個/ml接種于25
7、cm2培養(yǎng)瓶中，置于5%C02,37°C,飽和濕度95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時后，輕輕吸出上清，并加入新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)24小時后輕輕吹打，使未貼壁的細胞懸浮，吸出上清，加入新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。以后每天換液1次，并觀察細胞形態(tài)。1.2.2小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的傳代培養(yǎng)原代細胞生長接近瓶底的80%吋，吸去上清，加入0.125%胰蛋白酶，37°C條件下消化并觀察細胞形態(tài)，待細胞呈球形、不在粘連時吸棄胰酶，加入新鮮培養(yǎng)液重懸細胞，4°C3000rpm離心3分鐘，棄上清，再加入培養(yǎng)液重懸細胞，反復(fù)吹打混勻，按1:2比例
8、接種到新的培養(yǎng)瓶，置于5%C02,37°C,飽和濕度95%的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，仍然每天換液，直至細胞貼壁融合成片，接近瓶底80%吋，重復(fù)以上操作，再次傳代。1.2.3小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的表型鑒定收獲第4代及第8代生長良好的細胞，胰酶消化后，4°Cl000rpm離心5分鐘，棄上清，PBS洗滌細胞2次，每代細胞分別設(shè)2管，調(diào)節(jié)每管細胞數(shù)為5×105,分別加入CD29和CD44
