阿魏酸鈉抑制高糖誘導的系膜細胞增殖論文

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1、阿魏酸鈉抑制高糖誘導的系膜細胞增殖論文石明雋羅華肖瑛桂華珍郭兵張國忠【摘要】目的探討阿魏酸鈉(SF)對高糖誘導的原代培養(yǎng)系膜細胞(GMC)增殖的作用及其機制。方法原代培養(yǎng)腎小球系膜細胞，分為正常組、甘露醇組、高糖組、高糖加不同濃度SF組，分別于處理后24、48h收集細胞。用MTT法檢測細胞增殖；流式細胞術測定cyclinD1和細胞周期；免疫細胞化學檢測p53蛋白的表達。結果48h內，高糖促進GMC增殖，使GMC由G1期進入S期細胞比例增高；同時cyclinD1蛋白表達上調而p53蛋白的表達減少；SF能明顯對抗高糖的這種作用，其作用隨SF濃度的增加、作用時間

2、的延長而加強。結論SF可能通過抑制cyclinD1蛋白表達和促進p53蛋白生成，從而抑制高糖誘導的GMC增殖。【關鍵詞】系膜細胞；高葡萄糖；阿魏酸鈉；細胞周期；cyclinD1；p53【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectsandmechanismofsodiumferulate(SF)ontheproliferationofmesangialcellsinducedbyhighglucose.MethodsTheprimaryglomerularmesangialcellsal,mannitol,highglo

3、ucoseandhighgloucoseplusdifferentconcentrationSFgroups.CellseasuredbyMTTassay,andcellcycleandcyclinD1easuredthroughfloetry.p53proteinexpressionmunocytochemistry.ResultsHighglucosesignificantlypromotedmesangialcellproliferationandupregulatedtheexpressionofcyclinD1,.freelesangialce

4、llproliferationinducedbyhighglucoseedependedmanner.ConclusionsSFcaninhibitproliferationofmesangialcellsinducedbyhighglucosebysuppressingthecyclinD1expressionandincreasingthelevelofp53proteinpossibly.【Keyferulate;CyclinD1;p53糖尿病腎病(DN)的發(fā)病機制十分復雜，至今尚未完全闡明.freela公司)；胎牛血清(FCS，Hyclone)；

5、抗cyclinD1抗體、p53抗體、SABC試劑盒(武漢博士德)。CO2孵箱(美國REVCO)；倒置顯微鏡(OLYMPUS)；酶標儀(美國BioRad)；流式細胞儀(美國BD)；CM2000B型生物醫(yī)學圖象分析系統(北航)。1.2方法1.2.1大鼠原代GMC培養(yǎng)大鼠雙腎灌洗后，分級篩網濾過分離腎小球，并用Ⅳ型膠原酶消化處理，種植法體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞。培養(yǎng)細胞按已建立的方法鑒定〔7〕，確定為系膜細胞，供實驗用。1.2.2實驗分組正常組(5.5mmol/LD葡萄糖)；SF+正常組(SF240mg/L＋5.5mmol/LD葡萄糖)；甘露醇組(5.

6、5mmol/LD葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇)；高糖組(30mmol/LD葡萄糖)；SF+高糖培養(yǎng)組(SF60、120、240mg/L+30mmol/LD葡萄糖)。各組分別于培養(yǎng)24和48h時收集細胞用于檢測。1.2.3MTT法檢測系膜細胞增殖將原代GMC分組，每組三復孔，細胞周期同步后，SF作用20h和44h，每孔加入MTT(5mg/ml)20μl，繼續(xù)作用4h，去上清，然后每孔加入DMSO200μl，輕微振蕩30min，酶標儀570nm處測光吸收值(A)。用臺盼藍染色，檢測存活細胞數。1.2.4流式細胞儀檢測腎小球系膜細胞的細胞周期調整GM

7、C數為5×105個/ml，接種于50ml培養(yǎng)瓶中，加入適量的含10％FCS的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，孵育到亞融合狀態(tài)，改用無血清培養(yǎng)液孵育24h，使細胞處于相對靜止期(G1期)。分別于24和48h收集制成單細胞懸液，PBS洗滌2次，用PBS調節(jié)細胞數為1×106個/ml，分裝于6個EP管中(1ml/管)，無水乙醇固定，加人RNA酶Ⅰ孵育后，流式細胞儀對細胞周期進行檢測，MCYCLE軟件分析細胞周期。1.2.5流式細胞儀測定cyclinDl的表達水平按1.2.4步驟收集各組細胞，無水乙醇固定，加入0.5ml0.1%TritonX100，每組12管細胞隨機分為6管

8、陰性對照，6管實驗組，對照組加入50μl生理鹽水代替一抗，實驗組分