當歸多糖硫酸酯的合成及其對脾細胞增殖的作用論文

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1、當歸多糖硫酸酯的合成及其對脾細胞增殖的作用論文.freelgg-1，產(chǎn)率為0.737～0.884gg-1.當歸多糖及其硫酸酯在劑量為500mgL-1和1500mgL-1時，給藥組光密度明顯高于對照組（P0.01），作用與劑量有良好的正相關(guān)性.結(jié)論提高氯磺酸的比例，可以提高產(chǎn)物的硫含量，但收率降低.當歸多糖及其硫酸酯對活化的T細胞增殖有直接促進作用.Keyousesplenocyteproliferation.METHODSAn-gelicaSinensispolysaccharide（AP-Ⅰ）ethod;theestersulfateatedturbidimetr

2、icallyasbariumsulfate;theeffectsofAPSsonmousesplenocyteproliferationgg-1.BothAP-ⅠandAPSsenhancedmousesplenocytepro-liferationatdose500mgL-1and1500mgL-1（P0.01）.CONCLUSIONByincreasingtheratioofchlorosulfonicacid.freelotingeffectsonactiveTcellproliferation.0引言多糖作為非特異性免疫調(diào)節(jié)劑在抗腫瘤、抗肝炎、抗衰老等方面受

3、到廣泛關(guān)注.20世紀60年代以來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，一些半合成硫酸化多糖，如香菇多糖、右旋糖酐、牛膝多糖的硫酸化衍生物，是多種有胞膜病毒的強大抑制劑，尤其是具有抗HIV-Ⅰ的活性，引起廣泛的重視.在體內(nèi)、外實驗中，硫酸化多糖均表現(xiàn)出良好的抗病毒作用.日本學(xué)者研究了海藻中的天然硫酸化多糖，發(fā)現(xiàn)其在體內(nèi)具有抗腫瘤作用，而體外無效［1］.硫酸化多糖的免疫促進活性被認為是整體情況下抗病毒、抗腫瘤作用的重要機制之一.中藥當歸（AngelicaSinensis，Oliv）中水溶性多糖具有增強免疫系統(tǒng)功能的作用［2］.我們選擇從新鮮當歸中提取的水溶性當歸多糖（AP-Ⅰ），對其進行硫酸酯化修

4、飾，探討氯磺酸用量對收率和產(chǎn)物硫含量的影響，并比較了當歸多糖及其硫酸酯對小鼠脾細胞增殖反應(yīng)的影響，為進一步研究其活性奠定基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料①主要試劑及儀器:BECKMANDU-600型紫外可見分光光度計（USA）;DG3022A型酶聯(lián)免疫檢測儀（國營華東電子管廠）;PE-983紅外光譜儀（F）為國產(chǎn)分析純，吡啶、DMF使用前重蒸并干燥;MTT，Sigma產(chǎn)品;RPMI1640培養(yǎng)液，Gibco產(chǎn)品.②動物:6～8周齡的BABL/c純系小鼠，雄性，18～22g，由本校實驗動物中心提供.1.2方法①當歸多糖的提取:采自岷縣的新鮮當歸，經(jīng)水煮、醇沉、透析、除蛋白

5、、冷凍干燥，得純白色粉末狀當歸多糖，其中糖的含量為97%，蛋白的含量為3%.②多糖硫酸酯的合成用氯磺酸-吡啶法［3，4］，將吡啶60mL加入附有冷凝管和攪拌裝置的500mL三頸瓶中，冰鹽浴冷卻下，用恒壓漏斗慢慢滴入氯磺酸4～25mL，約10～40min滴加完畢，燒瓶中出現(xiàn)大量淡黃色固體.AP-Ⅰ4.0g，混懸于120mLDMF中，超聲波處理20min后，加入三頸瓶.立即將三頸瓶移入預(yù)熱至約100℃的石蠟浴中，恒溫反應(yīng)1h.冷至室溫，將反應(yīng)液傾入冰水中，2.5molL-1NaOH調(diào)至中性，加入三倍體積無水乙醇，析出沉淀.離心收集沉淀，并將沉淀溶于適量水，用去離子水透析

6、3d，未透液經(jīng)濃縮、冷凍干燥得淡黃色當歸多糖硫酸酯（APS）.③糖含量分析用硫酸-苯酚法［5］;硫含量分析用BaSO4比濁法［6］;同時還用紫外光譜分析和紅外光譜分析.④脾細胞增殖反應(yīng)常規(guī)制備小鼠脾細胞，調(diào)整細胞濃度為（5×109）L-1，加入96孔圓底培養(yǎng)板，設(shè)對照組:100μL細胞懸液+100μL1640培養(yǎng)液;加藥組:100μL細胞懸液+80μL1640培養(yǎng)液+20μL藥物.每個藥物濃度設(shè)3個復(fù)孔，37℃50mLL-1CO2下培養(yǎng)72h后，MTT法［7］測定結(jié)果.統(tǒng)計學(xué)處理:實驗結(jié)果進行t檢驗.2結(jié)果2.1氯磺酸對反應(yīng)的影響固定吡啶的用量，提高氯磺酸的比例，氯

7、磺酸-吡啶鹽（淡黃色固體）生成增多至出現(xiàn)板結(jié)，攪拌困難，加入DMF可溶解，多糖易被酯化，產(chǎn)率降低，產(chǎn)物顏色加深呈紅褐色，但取代度（DS）高.降低氯磺酸比例，可以提高產(chǎn)率，但取代度低（Tab1）.表1氯磺酸濃度對多糖硫酸化反應(yīng)的影響略當歸多糖硫酸酯的紫外光譜和紅外光譜分析結(jié)果一致.除顯示當歸多糖母體的特征吸收外，紫外光譜在260nm處，紅外光譜在1240cm-1和820cm-1附近有硫酸酯鍵的特征吸收，且與當歸多糖相比產(chǎn)物的羥基吸收也大為減小，也表明部分羥基被酯化.2.2脾細胞增殖反應(yīng)在500mgL-1和1500mgL-1劑量下，當歸多糖及其硫酸酯均能顯著促進脾細