mrna差異顯示技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用

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1、mRNA差異顯示技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用　　mRNA差異顯示技術(shù)（mRNAdifferentialdisplay）是一種快速而有效的克隆差異性表達(dá)基因的方法。1992年Liang和Pardee［1］首次應(yīng)用差異顯示技術(shù)對(duì)比人類乳腺癌細(xì)胞與正常乳腺上皮細(xì)胞所表達(dá)的mRNA，以此來(lái)克隆癌細(xì)胞所特有的基因。差異顯示技術(shù)為尋找新基因開辟了捷徑，是該領(lǐng)域的重大突破,已應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，如農(nóng)業(yè)、植物、動(dòng)物、醫(yī)學(xué)；就醫(yī)學(xué)而言，涉及了胚胎發(fā)育器官形成、遺傳性疾病、藥物作用原理、基因治療和免疫反應(yīng)等研究領(lǐng)域，特別是在人類與腫瘤的戰(zhàn)斗中有著極為廣泛的用途。　　差異顯示的理論基礎(chǔ)是基因的選擇性表達(dá)。哺乳動(dòng)物基因

2、組約含100000個(gè)不同的基因，對(duì)于某一細(xì)胞而言，僅一小部分（約15%）表達(dá)。在正常細(xì)胞的生長(zhǎng)分化過(guò)程中，基因的選擇性表達(dá)決定著生命的進(jìn)程；在病理過(guò)程中，作為疾病的原因或結(jié)果，也存在著表達(dá)的基因異常。因此克隆這些差異表達(dá)的基因是當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，該領(lǐng)域的不斷深入將為從分子水平了解疾病的發(fā)生和發(fā)展規(guī)律奠定基礎(chǔ)，并為臨床合理的治療提供依據(jù)?！　〔町愶@示的關(guān)鍵在于選擇具有高度可比性，表型特性差異顯著的對(duì)比對(duì)象?？杀刃约磭?yán)格控制遺傳背景，摒除無(wú)關(guān)差異，僅使所關(guān)注的表型（如腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能）具有顯著差異。差異顯示從表型差異入手，通過(guò)展示mRNA的差異深入到基因差異，克隆與表型差異高度

3、相關(guān)的新基因。　　就技術(shù)而言，差異顯示巧妙地結(jié)合了兩個(gè)基本的分子生物技術(shù)：逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及電泳。經(jīng)過(guò)不斷的改良，差異顯示已成為標(biāo)準(zhǔn)化的cDNA克隆方法，有多個(gè)公司的試劑盒及設(shè)備使研究者可在短時(shí)間內(nèi)啟動(dòng)差異顯示，幾天內(nèi)獲得結(jié)果。較其他克隆新基因的方法而言，差異顯示具有簡(jiǎn)便易行的優(yōu)勢(shì)，因此在基礎(chǔ)和臨床研究中有著推廣和普及的可能性?！　∫弧⒓夹g(shù)路線　　差異顯示技術(shù)實(shí)質(zhì)是RT-PCR,其獨(dú)特之處在于2種PCR引物的設(shè)計(jì):錨定引物T12MN,含12個(gè)T可以結(jié)合于mRNA3’端poly(A)，M為AGC3種堿基之一，N為AGCT之一，如T12CA可結(jié)合于在poly(A)上游為

4、GT的mRNA；隨機(jī)引物可以在與poly(A)末端不同距離的多個(gè)位置上結(jié)合，因此差異顯示的產(chǎn)物是不同長(zhǎng)度的cDNA片段混合物。通過(guò)隨機(jī)引物和錨定引物的多種組合,差異顯示有展示約10000至15000種mRNA的潛力，在DNA測(cè)序膠上對(duì)比細(xì)胞或組織中所表達(dá)的mRNA，從而尋找在不同細(xì)胞，不同發(fā)育和分化階段，不同部位差異表達(dá)的基因。目前引物的設(shè)計(jì)更為新穎有效，如GenHunter公司在引物末端加入HindIII酶切位點(diǎn)，便于克??；Genomyx公司則在錨定引物5′末端加入T7RNA多聚酶啟動(dòng)子,在隨機(jī)引物3′末端加入M13引物序列,便于直接合成反義RNA探針及直接的雙相測(cè)序。隨引物的延長(zhǎng),

5、退火溫度可由40℃提高到46℃,提高了差異顯示的重復(fù)性。另外可針對(duì)某一基因家族(如Ser/Thr激酶［2］,鋅指蛋白家族［3］)設(shè)計(jì)引物,使所獲得的差異基因相對(duì)集中?！　∑浼夹g(shù)路線為：首先提取高質(zhì)量的總RNA,DNA酶處理后利用錨定引物T12MN逆轉(zhuǎn)錄,其后應(yīng)用相同的T12MN及隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；同時(shí)摻入同位素來(lái)標(biāo)記產(chǎn)物。產(chǎn)物用測(cè)序膠電泳分離，放射自顯影。將差異條帶切下，用相同的引物進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物經(jīng)標(biāo)記制成探針，通過(guò)Northern雜交來(lái)驗(yàn)證其在不同樣本中的表達(dá)差異，去除假陽(yáng)性(RNase保護(hù)實(shí)驗(yàn)由于雜交發(fā)生在小體積中有利于復(fù)性，可用來(lái)替代Northern雜交，特別是對(duì)

6、于低轉(zhuǎn)錄水平的mRNA更為用效，可以探測(cè)到單個(gè)細(xì)胞中1～5個(gè)拷貝數(shù)的mRNA)。被證實(shí)的cDNA片段可克隆到T/A載體中進(jìn)行測(cè)序，其序列與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性檢驗(yàn)，便可確定是已知基因或者是與已知基因無(wú)顯著同源性的未知基因。目前已有多種非放射性標(biāo)記方法,如溴化乙錠染色的瓊脂糖電泳［4］(簡(jiǎn)便,但靈敏度低)、銀染［5］(快速,靈敏度高,便于切條帶)、熒光［6］(應(yīng)用熒光成象系統(tǒng),自動(dòng),靈敏度高,應(yīng)用廣泛)及化學(xué)發(fā)光［7］?！　《?、差異顯示的優(yōu)越性　　1.差異顯示僅需少量的總RNA（0.2～0.02μg,約相當(dāng)于從200個(gè)細(xì)胞中所提取的總RNA）。這使得材料來(lái)源困難的研究成為可能，

7、如細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，內(nèi)窺鏡活檢標(biāo)本等。用總RNA和poly(A)RNA做模板可獲得相同結(jié)果，這也說(shuō)明在大量的tRNA，rRNA存在的情況下，錨定引物T12MN能特異的結(jié)合于mRNApoly(A)的尾部?！　?.差異顯示應(yīng)用PCR技術(shù)，起到了放大作用，敏感度高。為了篩選低轉(zhuǎn)錄水平的mRNA已進(jìn)行了許多改良，如Hakvoort等［8］將消減雜交與差異顯示結(jié)合，先通過(guò)雜交使差異片段富集，再進(jìn)行并列比較，則低轉(zhuǎn)錄水平的mRNA得到展示的可能性大大提高