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《mRNA差異顯示技術(shù)在腫瘤探究中應(yīng)用.doc》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、mRNA差異顯示技術(shù)在腫瘤探究中應(yīng)用mRNA差異顯示技術(shù)(mRNAdifferentialdisplay)是一種快速而有效的克隆差異性表達(dá)基因的方法。1992年Liang和Pardee[1]首次應(yīng)用差異顯示技術(shù)對比人類乳腺癌細(xì)胞與正常乳腺上皮細(xì)胞所表達(dá)的mRNA,以此來克隆癌細(xì)胞所特有的基因。差異顯示技術(shù)為尋找新基因開辟了捷徑，是該領(lǐng)域的重大突破，已應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，如農(nóng)業(yè)、植物、動(dòng)物、醫(yī)學(xué)；就醫(yī)學(xué)而言，涉及了胚胎發(fā)育器官形成、遺傳性疾病、藥物作用原理、基因治療和免疫反應(yīng)等研究領(lǐng)域，特別是在人類與腫瘤的戰(zhàn)斗中有著極為廣泛的用途。差異顯示的理論基礎(chǔ)是基因的選擇性表達(dá)。哺乳動(dòng)物基因
2、組約含100000個(gè)不同的基因，對于某一細(xì)胞而言，僅一小部分(約15%)表達(dá)。在正常細(xì)胞的生長分化過程中，基因的選擇性表達(dá)決定著生命的進(jìn)程；在病理過程中，作為疾病的原因或結(jié)果，也存在著表達(dá)的基因異常。因此克隆這些差異表達(dá)的基因是當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，該領(lǐng)域的不斷深入將為從分子水平了解疾病的發(fā)生和發(fā)展規(guī)律奠定基礎(chǔ)，并為臨床合理的治療提供依據(jù)。差異顯示的關(guān)鍵在于選擇具有髙度可比性，表型特性差異顯著的對比對象?？杀刃约磭?yán)格控制遺傳背景，摒除無關(guān)差異，僅使所關(guān)注的表型(如腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能)具有顯著差異。差異顯示從表型差異入手，通過展示mRNA的差異深入到基因差異，克隆與表型差
3、異高度相關(guān)的新基因。就技術(shù)而言，差異顯示巧妙地結(jié)合了兩個(gè)基本的分子生物技術(shù)：逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及電泳。經(jīng)過不斷的改良，差異顯示已成為標(biāo)準(zhǔn)化的cDNA克隆方法，有多個(gè)公司的試劑盒及設(shè)備使研究者可在短時(shí)間內(nèi)啟動(dòng)差異顯示，幾天內(nèi)獲得結(jié)果。較其他克隆新基因的方法而言，差異顯示具有簡便易行的優(yōu)勢，因此在基礎(chǔ)和臨床研究中有著推廣和普及的可能性。一、技術(shù)路線差異顯示技術(shù)實(shí)質(zhì)是RT-PCR,其獨(dú)特之處在于2種PCR引物的設(shè)計(jì)：錨定引物T12MN,含12個(gè)T可以結(jié)合于mRNA3'端poly(A),M為AGC3種堿基之一，N為AGCT之一,如T12CA可結(jié)合于在poly(A)±
4、游為GT的mRNA；隨機(jī)引物可以在與poly(A)末端不同距離的多個(gè)位置上結(jié)合，因此差異顯示的產(chǎn)物是不同長度的cDNA片段混合物。通過隨機(jī)引物和錨定引物的多種組合，差異顯示有展示約10000至15000種mRNA的潛力，在DNA測序膠上對比細(xì)胞或組織中所表達(dá)的mRNA,從而尋找在不同細(xì)胞，不同發(fā)育和分化階段，不同部位差異表達(dá)的基因。目前引物的設(shè)計(jì)更為新穎有效，如GenHunter公司在引物末端加入Hindlll酶切位點(diǎn)，便于克??；Genomyx公司則在錨定引物5'末端加入T7RNA多聚酶啟動(dòng)子，在隨機(jī)引物3,末端加入M13引物序列，便于直接合成反義RNA探針及直接的雙相測序。
5、隨引物的延長，退火溫度可由4CTC提高到469,提高了差異顯示的重復(fù)性。另外可針對某一基因家族（如Ser/Thr激酶［2］,鋅指蛋白家族［3］）設(shè)計(jì)引物，使所獲得的差異基因相對集中。其技術(shù)路線為：首先提取高質(zhì)量的總RNA,DNA酶處理后利用錨定引物T12MN逆轉(zhuǎn)錄，其后應(yīng)用相同的T12MN及隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；同時(shí)摻入同位素來標(biāo)記產(chǎn)物。產(chǎn)物用測序膠電泳分離，放射自顯影。將差異條帶切下，用相同的引物進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物經(jīng)標(biāo)記制成探針，通過Northern雜交來驗(yàn)證其在不同樣本中的表達(dá)差異，去除假陽性（RNase保護(hù)實(shí)驗(yàn)由于雜交發(fā)生在小體積中有利于復(fù)性，可用來替代Nort
6、hern雜交，特別是對于低轉(zhuǎn)錄水平的mRNA更為用效，可以探測到單個(gè)細(xì)胞中1?5個(gè)拷貝數(shù)的mRNA）。被證實(shí)的cDNA片段可克隆到T/A載體中進(jìn)行測序，其序列與Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性檢驗(yàn)，便可確定是已知基因或者是與已知基因無顯著同源性的未知基因。目前已有多種非放射性標(biāo)記方法，如漠化乙錠染色的瓊脂糖電泳［4］（簡便，但靈敏度低）、銀染［5］（快速，靈敏度高，便于切條帶）、熒光［6］（應(yīng)用熒光成象系統(tǒng)，自動(dòng)，靈敏度高，應(yīng)用廣泛）及化學(xué)發(fā)光［7］。二、差異顯示的優(yōu)越性1.差異顯示僅需少量的總RNA（0.2?0.02ug,約相當(dāng)于從200個(gè)細(xì)胞中所提取的總RNA）。這使得材料
7、來源困難的研究成為可能，如細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，內(nèi)窺鏡活檢標(biāo)本等。用總RNA和poly（A）RNA做模板可獲得相同結(jié)果，這也說明在大量的tRNA,rRNA存在的情況下，錨定引物T12MN能特異的結(jié)合于mRNApoly（A）的尾部。2.差異顯示應(yīng)用PCR技術(shù)，起到了放大作用，敏感度高。為了篩選低轉(zhuǎn)錄水平的mRNA已進(jìn)行了許多改良，如Hakvoort等［8］將消減雜交與差異顯示結(jié)合，先通過雜交使差異片段富集，再進(jìn)行并列比較，則低轉(zhuǎn)錄水平的mRNA得到展示的可能性大大提高。又如Ralph等［9］通過2輪PCR擴(kuò)
