應(yīng)用 mRNA 差異顯示技術(shù)克隆常見舌苔相關(guān)基因.doc

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1、應(yīng)用mRNA差異顯示技術(shù)克隆常見舌苔相關(guān)基因作者:秦鑒吳正治吳國(guó)珍劉紅健【摘要】目的:篩選、克隆常見舌苔厚度變化的相關(guān)基因。方法:利用熒光差異顯示技術(shù)(FDD),選擇厚膩苔、正常薄白苔、病理薄白苔、光剝苔各10例,提取其舌苔組織與正常人薄白苔組織中mRNA,通過電泳找到mRNA表達(dá)的差異。獲得的差異表達(dá)cDNA片段經(jīng)Notthern印跡證實(shí)后進(jìn)行克隆和測(cè)序,分析其來源。結(jié)果:發(fā)現(xiàn)45條差異表達(dá)cDNA片斷(38條證實(shí)為陽性),其中5條與人類98%以上同源,皆與細(xì)胞凋亡有關(guān)。結(jié)論:舌苔厚度變化與促進(jìn)和抑制舌苔上皮細(xì)胞的凋亡基因有密切關(guān)系

2、?!娟P(guān)鍵詞】舌苔;差異顯示;基因在中醫(yī)的四診中,舌診以其客觀、明了、直接,被歷代醫(yī)家所重視。事實(shí)上,在中醫(yī)臨床辨證、立法、遣方、用藥以及判斷疾病轉(zhuǎn)歸、估計(jì)病情預(yù)后等方面,舌診發(fā)揮著重要的作用[1]。目前,對(duì)舌苔形成原理的研究已逐漸深入到亞細(xì)胞水平和分子層次[2-4]。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為,舌苔的形成是胃氣上蒸于舌面的結(jié)果,這種闡釋過于抽象、感性和簡(jiǎn)單。隨著科技水平的迅猛發(fā)展,研究中醫(yī)舌診中的分子生物學(xué)事件已經(jīng)是人們深入研究中醫(yī)疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)理的必然途徑。本研究擬采用先進(jìn)、簡(jiǎn)便、成熟的差異顯示逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(DDRT-PCR)法,從相關(guān)

3、基因?qū)哟翁接懗R娚嗵Πl(fā)生、發(fā)展、變化的機(jī)制,探尋其分子生物學(xué)基礎(chǔ),豐富舌苔診斷的內(nèi)容,全面認(rèn)識(shí)舌苔產(chǎn)生的本質(zhì)、完善中醫(yī)舌苔理論、指導(dǎo)臨床的診斷治療、促進(jìn)中醫(yī)診斷的客觀化、定量化、規(guī)范化。1對(duì)象與方法1.1標(biāo)本來源病理舌苔受檢者均系中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診及住院病人,病種不限,但注意各組病種分布的平衡;正常組選擇無全身各系統(tǒng)器質(zhì)性病變,并排除近月內(nèi)舌、口、鼻、咽等局部病變,舌質(zhì)淡紅、舌苔白而潤(rùn)者。參考《中醫(yī)診斷學(xué)》舌診標(biāo)準(zhǔn)辨舌苔[5],分為4組:正常薄白苔組10例,其中男6例,女4例,年齡33~52歲;病理薄苔組10例,男4例,女6例,

4、年齡38~55歲;厚苔組10例,男7例,女3例,年齡46~63歲;剝苔組10例,男5例,女5例,年齡45~67歲。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各組性別、年齡分布無顯著性差異。80例進(jìn)行臨床驗(yàn)證:正常薄白苔組20例,男10例,女10例,年齡38~55歲;病理薄苔組20例,男11例,女19例,年齡43~56歲;厚苔組20例,男7例,女13例,年齡36~58歲;剝苔組20例,男9例,女11例,年齡46~61歲。兩次研究對(duì)象組間性別、年齡分別比較,無顯著差異(P>0.05)。5每個(gè)觀察對(duì)象用經(jīng)高溫高壓消毒的絲瓜絡(luò)用力刮取舌背中部(花剝苔者取無舌苔覆蓋

5、部位)舌苔,裝于有預(yù)冷生理鹽水(含0.1%DEPC)的10mL具塞離心管中,洗滌、涂片后-70℃密閉保存?zhèn)溆谩?.2總RNA的抽提取冷藏標(biāo)本1mLTrizol試劑(美國(guó)GIBCOBRL公司)中快速電動(dòng)勻漿,按廠家提供說明抽提組織總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA質(zhì)量,紫外分光光度儀測(cè)定濃度及純度,總RNA的A260/A280比值在19~20之間。1.3熒光差異顯示熒光差異顯示試劑盒(mRNAprofileKit、fluoroDDKit購(gòu)自美國(guó)Beckman公司)。1.3.1逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將取四組樣品的總RNA,稀釋至0.5g/L,取2LR

6、NA,加2L2mol/L的3′錨式引物,70℃溫育5min,在冰上快速冷卻。加入2Ll250mol/LdNTP,2L100mmol/LDTT,4L5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液,7.8L無RNA酶水,0.2L200U/L逆轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)GIBCOBRL公司),42℃溫育5min,50℃溫育50min。72℃溫育15min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶,-20℃保存?zhèn)溆谩?.3.2PCR反應(yīng)0.95L水,1L10×PCR緩沖液,1.5L25mmol/LMgCl2,2L250mol/LdNTP,1.75L2mol/L5′隨機(jī)引物,0.7L5mol/L熒光素標(biāo)記的3′錨式引

7、物,2L逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,0.1L5U/LTaq酶(GIBCOBRL),在PCR儀上進(jìn)行如下反應(yīng):95℃2min;94℃30s,50℃40s,72℃2min,共4個(gè)循環(huán);94℃30s,60℃40s,72℃2min,共30個(gè)循環(huán);72℃延伸7min;保存在4℃。PCR產(chǎn)物上樣于5.6%的聚丙烯酰胺凝膠,在GenomyxLR電泳儀上進(jìn)行垂直高壓電泳5h。電泳結(jié)束后50℃干膠15min,然后在在GenomyxSC熒光圖像掃描儀下掃描圖像,比較、確定有差異的cDNA條帶。1.4差異條帶的回收及再擴(kuò)增利用方格圖定位,切取含有差異cDNA條帶的干膠條,

8、浸于50LTE溶液中搗碎,37℃孵育1h。取其中的4L用通用引物M13和T7進(jìn)行再擴(kuò)增。二次PCR反應(yīng)體系為189L水,4L10×PCR緩沖液,15L25mmol/LMgCl2,32L250mol/LdNTP,各4L2m

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