資源描述：
《銀染mrna差異顯示法克隆肝癌相關(guān)基因論文》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、銀染mRNA差異顯示法克隆肝癌相關(guān)基因論文.freelRNA差異顯示法關(guān)鍵詞:腫瘤;mRNA差異顯示法;銀染;基因克隆中圖號(hào):R735.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A摘要:目的建立銀染mRNA差異顯示方法，篩選并克隆肝癌相關(guān)基因.方法以建系的人肝癌細(xì)胞HepG2和正常的肝細(xì)胞L02的總RNA為模板，用5’-dT11G錨定引物和8條隨機(jī)引物（AP1～AP8）組合進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)60gL-1尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，凝膠銀鹽染色顯示差異的DNA片段.結(jié)果建立了快速敏感的銀染mRNA差異顯示方法.freelRNA差
2、異顯示法簡(jiǎn)單、有效，在差異表達(dá)基因的篩選中有較高的實(shí)用價(jià)值.Keyor;mRNAdifferentialdisplay;silverstain-ing;cloningofgeneAbstract:AIMTodevelopmRNAdifferentialdisplaypoly-merizechainreaction（DD-PCR）methodtheHepG2cellsandL02cells.TheirfirststrainsofcDNAplifiedbyPCRusingananchoredprimer5’dT11Gbine
3、dersrespectively.TheproductsofPCRidegel.ThedifferentialDNAbandsongelRNAdifferen-tialdisplaydeveloped.CONCLUSIONTheestablishedmR-NAdifferentialdisplaymethod-ple，efficientmeansRNA差異顯示（mRNAdifferentialdisplayPCR，DD-PCR）方法是分離差異表達(dá)基因的有效方法［1，2］.自從DD-PCR發(fā)明以來(lái)，已被廣泛用于多種差異基因
4、的篩選和克隆，即使DD-PCR方法有一定的局限性［3，4］，但近年來(lái)仍有許多成功的范例［5-9］.雖然新的差異篩選方法如代表性cDNA差異顯示，消減雜交和抑制性消減雜交等應(yīng)運(yùn)而生并異軍突起，但因DD-PCR相對(duì)簡(jiǎn)單、直觀、有效而仍受眾多研究者的青睞［10-13］.常規(guī)mRNA差異顯示法是通過(guò)放射性同位素進(jìn)行放射自顯影來(lái)比較表達(dá)基因的差異，因而給本方法的普及和操作帶來(lái)了一定的困難，熒光染料法雖避免了同位素放射自顯影帶來(lái)的不便，但其價(jià)格較貴，且靈敏度與銀染法相近.因而建立一套快速、簡(jiǎn)便、價(jià)廉、易掌握和推廣的銀染mRNA差異顯
5、示實(shí)用技術(shù)，在眾多差異基因的初步篩選中具有很高的應(yīng)用價(jià)值.我們結(jié)合自己的工作，以此方法從肝癌細(xì)胞中初步分離并鑒定了一些肝癌相關(guān)基因.1材料和方法1.1材料人肝癌細(xì)胞系HepG2和正常肝細(xì)胞系L02購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物研究所.菌株DH5α由本室保存.pUC-Tm載體購(gòu)自上海生物工程公司.總RNA提取試劑盒，膠回收試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒為上海生工產(chǎn)品.反轉(zhuǎn)錄酶M-MulV，Taq-PlusⅠ聚合酶為MBI產(chǎn)品，錨定引物和隨機(jī)引物由生工合成.放射性同位素購(gòu)自北京亞輝公司（α-32P-dATP和α-32P-dCTP）.1.2方
6、法處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2和L02細(xì)胞經(jīng)酶消化后回收，清洗后，用總RNA提取試劑盒提取兩種細(xì)胞的總RNA，紫外檢測(cè)儀測(cè)兩種樣品RNA的A260/A280，測(cè)RNA的含量和純度，并用甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)樣品中RNA分子的完整性;進(jìn)一步用無(wú)RNA酶的DNA酶消化去除樣品中可能含有的微量基因組DNA.各取5μgRNA樣品，以H-T11G為錨定引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，然后以cDNA第1鏈為模板，T11G和8條隨機(jī)引物（AP1～AP8）分別組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)組成:在20μL體系中，RT產(chǎn)物各2μL，10×PCR
7、buffer2μL，MgCl2（25mmolL-1）1.6μL，dNTP（400molL-1）1μL，T11G（4μmolL-1）1μL，Taq-DNA聚合酶0.15μL，去離子水11.25μL.PCR條件:95℃3min，94℃30s，40℃2min，72℃40s，40個(gè)循環(huán)，然后70℃10min終止反應(yīng).60gL-1尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳:配制17cm×17cm×0.15cm60gL-1尿素變性膠，各取8μLPCR產(chǎn)物，加入上樣buffer，95℃變性3min，迅速冰浴，然后依次上樣，TBE為電泳緩沖液，200～
8、300V恒壓電泳6～8h，至二甲苯氰指示劑抵達(dá)膠底時(shí)結(jié)束電泳.凝膠銀鹽染色展示差異DNA條帶參照文獻(xiàn)［14-16］，略加修改.具體操作步驟:取下凝膠放入干凈的玻璃器皿（托盤(pán)）中，去離子漂洗2～3min;100mLL-1醋酸中搖動(dòng)固定30min;去離子水漂洗2min×3;AgNO3（1gL-1）+1.5mL，緩搖作用3
