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《銀染mrna差異顯示方法的條件優(yōu)化》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、ChinJNeurosci,1999;Vol15(2):151～155151技術(shù)方法1513銀染mRNA差異顯示方法的條件優(yōu)化331梁德勇 王曉民 崔振中 徐國(guó)恒 朱麗霞 韓濟(jì)生(1北京醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所 北京 100083;中國(guó)中醫(yī)研究院針灸研究所 北京 100700)摘要 mRNA差異顯示技術(shù)是分離差異表達(dá)基因的強(qiáng)有力工具。本工作旨在優(yōu)化無(wú)同位素的銀染差異顯示方法。以總RNA為模板,用錨定引物與隨機(jī)引物的組合進(jìn)行RT2PCR反應(yīng),PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在變性的聚丙烯酰胺凝膠上電泳。用銀染方法顯示電泳cDAN條帶,其結(jié)果是:(1)RNA加入量
2、為1～3Lg,RT2PCR反應(yīng)能擴(kuò)增出較多的cDNA條帶,而低于015Lg時(shí)擴(kuò)增條帶數(shù)目較少;(2)在36～42℃的范圍內(nèi),隨著溫度的增加,擴(kuò)增的條帶減少;而42℃時(shí)擴(kuò)增的條帶數(shù)目銳減,特別是當(dāng)RNA加入量小于1Lg時(shí)幾乎無(wú)條帶顯示;36℃擴(kuò)增的條帶過(guò)多而趨于smear;(3)優(yōu)化了銀染液程序,染色液和顯色液中37%甲醛的量分別為0103%～0105%和01075%～011%,顯色溫度4～12℃時(shí),顯示出清晰的條帶;(4)用此方法獲得數(shù)條電針鎮(zhèn)痛有效與無(wú)效大鼠表達(dá)差異的cDNA條帶。總之,通過(guò)改變參數(shù)條件,優(yōu)化了快速簡(jiǎn)便的銀染mRNA差異顯
3、示方法。關(guān)鍵詞 mRNA差異顯示 逆轉(zhuǎn)錄2聚合酶鏈反應(yīng) 銀染 基因表達(dá)OPTIMIZATIONOFmRNADIFFERENTIALDISPLAYWITHSILVERSTAINING1LIANGDe2Yong,WANGXiao2Min,CUIZhen2Zhong,XUGuo2Heng,ZHULi2Xia,HANJi2Sheng(1NeuroscienceResearchInstitute,BeijingMedicalUniversity,Beijing100083;TheInstituteofAcupunctureandMoxibustion
4、,ChinaAcademyofTraditionalChineseMedicine,Beijing100700)ABSTRACTmRNAdifferentialdisplayisapowerfulinstrumenttoidentifydifferentiallyexpressedgenes.Thisworkisdesignedtooptimizeanon2radioactivedifferentialdisplaywithsilverstaining.TotalRNAastemplatewasreversetranscribedintoc
5、orrespondingcDNAsby3′anchorprimerandthecDNAswereamplifiedbypolymerasechainreaction(PCR)withasetofonesame3′anchorprimerandone5′arbitrarilyprimer.ThePCRproductswerethenresolvedondenaturingpolyacylamimidegel.cDNAbandswerevisualizedbysilverstaining.Theresultsrevealedasfollows:
6、(1)TheamountofRNAusedwas1～3Lg,whichproducedmanycDNAbandsbyRT2PCR.FewofbandswereobservedwhentheamountofRNAwasreducedtolessthan0.5Lg.(2)cDNAbandsweredecreasedwithincreasingtemperatureinarangeof36～42℃.(3)Silverstainingprocedurewasmodified.Theconcentrationof37%formaldehydeinst
7、ainingsolutionanddevelopingsolutionwasoptimized,andthedevelopingtemperaturewasappropriateat4～12℃.(4)SeveralcDNAfragmentswereidentifiedfrombrainofresponderandnon2responderratforelectroacupu2ncture2inducedanalgesia.Inconclusion,thesilverstainingmRNAdifferentialdisplayoptimiz
8、edinparametersisarapidandeasyprocedure.3國(guó)家自然科學(xué)基金(No.39600192)資助課題 33聯(lián)系人Received1998211
