mrna差異顯示方法研究進展論文

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1、mRNA差異顯示方法研究進展論文哺乳動物細胞約有100?000個不同的基因,在一定時間、空間中僅有10%~15%的基因表達,這種表達受到嚴格調(diào)控[1]。運用mRNA差異顯示(differentialdisplay,DD)方法[2],可將不同細胞類型或同一細胞在不同環(huán)境下表達的基因進行比較,從分子生物學水平上提供信息,這對理解細胞的生命過程極有幫助。該技術(shù)一經(jīng)問世,立即得到廣泛應用,但同時也遇到許多問題.freelRNA群體通過逆轉(zhuǎn)錄方法變成相應的cDNA群體,以此為模板,利用一對特殊引物,即3anchor引物和5arbitrary引物,在一

2、定條件下進行PCR擴增,得到與mRNA相對應的“標簽”(tags),然后用變性聚丙烯酰胺測序膠分析其差別,將有差別的基因克隆化,進一步分析其結(jié)構(gòu)與功能。DD依賴三種技術(shù):(1)mRNA逆轉(zhuǎn)錄技術(shù);(2)以特定引物進行的PCR技術(shù);(3)DNA測序膠電泳技術(shù)。二、DD方法的優(yōu)點及其應用用某一方法來尋找mRNA表達的差異,至少要滿足下列要求:(1)在一定時間、空間里,每一個細胞約有15000種mRNA表達,其中除少數(shù)屬高豐度表達外,大量的屬于低豐度表達,即要求使用的方法足以顯示低豐度mRNA;(2)重復性要好;(3)實驗過程中能夠步步驗證比較(si

3、de-by-sideparison);(4)得到的產(chǎn)物能代表相應的mRNAs或cDNAs,并能由此找到相應的cDNA序列;(5)省時,簡便易行。既往對mRNA的比較研究中多用減數(shù)雜交方法[4](subtractionhybridization),該方法靈敏,可顯示低豐度RNA,但是步驟復雜,需時較長,而且在得到最終結(jié)果前無法步步驗證對照比較,故不易重復,并且需要大量的RNA作起始研究材料。這一點對RNA來源不易者(如手術(shù)活檢標本)極不利[5,6]。DD的優(yōu)點在于:(1)僅需0.2μg總RNA作為起始材料;(2)可同時分析多組樣品;(3)敏感性高

4、,可檢出低豐度mRNA;(4)實驗周期短,約8天即可完成[7],便于重復;(5)最突出的優(yōu)點是實驗過程中可步步驗證比較??珊唵蔚貙D的特點概括為“3SRV”,即“Simplicity,Sensitivity,Speed,Reproducibility,Versatility”。DD方法因有上述優(yōu)點,被廣泛應用。例如:Musholt等[8]應用DD方法對手術(shù)切下的髓樣甲狀腺癌標本與局部轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)進行了比較,發(fā)現(xiàn)了兩個新的表達基因MDF-1和MDF-2,并認為這兩個基因在髓樣甲狀腺癌的進展與轉(zhuǎn)移中起了重要作用;Zuo等[9]研究潰瘍性結(jié)腸炎的粘

5、膜細胞,以正常結(jié)腸粘膜細胞作對照,找到了25個表達基因,其中有些與甲狀旁腺瘤、T細胞受體-β、卵巢癌等表達的基因同源。關(guān)于神經(jīng)再生問題,Livesey等[10]發(fā)現(xiàn)了Reg-2基因,并認為該基因是哺乳類動物運動神經(jīng)元再生的關(guān)鍵基因。在骨科領(lǐng)域,也有許多用DD方法的研究,Ryoo等[11]找到了一個與成骨細胞表型發(fā)育有關(guān)的細胞增殖標志基因PROM-1(proliferatingcellmarker)。更令人鼓舞的是,Boden等[12]用一種新的骨形成蛋白LMP-1基因轉(zhuǎn)染骨髓細胞,再作局部基因治療,在動物實驗中成功地進行了脊柱融合,LMP-1基

6、因就是用DD方法克隆出來的。此外,DD還應用于心血管?。?3]、糖尿病[14]、胚胎發(fā)育[15]、先天性疾病[16]以及藥理學[17]和眼科學[18]等。不僅用于動物和人類,還應用于植物分子生物學研究[19]。三、存在的問題與對策DD方法存在的問題概括起來有兩方面:一是假陽性多(約50%~70%),二是得到的有差異cDNA片段短(約為110~500bp)。因為這兩個問題,使許多研究者踟躕不前,這也是Debouk[3]提出質(zhì)疑的原因之一。產(chǎn)生假陽性的原因,在于以下4個環(huán)節(jié):(1)提取總RNA時,有染色體DNA污染,此DNA作為模板在PCR過程中被

7、擴增;(2)從聚丙烯酰胺膠上挑選有差異條帶時,實驗組與對照組間信號對比不夠顯著;(3)在克隆階段挑選陽性菌落時,未能排除基因克隆中的假陽性;(4)研究中多次使用PCR技術(shù),很難避免實驗室環(huán)境中的交叉污染。解決這一問題的對策是:(1)提取RNA操作嚴格,得到的RNA必須經(jīng)過脫氧核糖核酸酶I(DNaseI)充分消化,去除染色體DNA污染。(2)從聚丙烯酰胺膠上切取有差異條帶時,首選實驗與對照間信號差異顯者,最好是互為有或無的關(guān)系;如果僅僅是強與弱的關(guān)系,放在次選位置上。(3)即使是差異顯著地顯現(xiàn)為一條帶,也不能肯定是由某一cDNA的均一分子泳動而成

8、,有可能是結(jié)構(gòu)不同而分子量相同的cDNA共泳動(Co-migrat)的結(jié)果。對此,可用mSSCP方法區(qū)別開來[7]。也可在基因克隆挑選時,用Rever

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