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《應(yīng)用 mRNA 差異顯示技術(shù)克隆常見舌苔相關(guān)基因.doc》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、應(yīng)用mRNA差異顯示技術(shù)克隆常見舌苔相關(guān)基因作者：秦鑒吳正治吳國珍劉紅健【摘要】目的：篩選、克隆常見舌苔厚度變化的相關(guān)基因。方法：利用熒光差異顯示技術(shù)（FDD），選擇厚膩苔、正常薄白苔、病理薄白苔、光剝苔各10例，提取其舌苔組織與正常人薄白苔組織中mRNA，通過電泳找到mRNA表達(dá)的差異。獲得的差異表達(dá)cDNA片段經(jīng)Notthern印跡證實(shí)后進(jìn)行克隆和測序，分析其來源。結(jié)果：發(fā)現(xiàn)45條差異表達(dá)cDNA片斷（38條證實(shí)為陽性），其中5條與人類98%以上同源，皆與細(xì)胞凋亡有關(guān)。結(jié)論：舌苔厚度變化與促進(jìn)和抑制舌苔上皮細(xì)胞的凋亡基因有密切關(guān)系
2、?！娟P(guān)鍵詞】舌苔；差異顯示；基因在中醫(yī)的四診中，舌診以其客觀、明了、直接，被歷代醫(yī)家所重視。事實(shí)上，在中醫(yī)臨床辨證、立法、遣方、用藥以及判斷疾病轉(zhuǎn)歸、估計(jì)病情預(yù)后等方面，舌診發(fā)揮著重要的作用[1]。目前，對舌苔形成原理的研究已逐漸深入到亞細(xì)胞水平和分子層次[2-4]。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為，舌苔的形成是胃氣上蒸于舌面的結(jié)果，這種闡釋過于抽象、感性和簡單。隨著科技水平的迅猛發(fā)展，研究中醫(yī)舌診中的分子生物學(xué)事件已經(jīng)是人們深入研究中醫(yī)疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)理的必然途徑。本研究擬采用先進(jìn)、簡便、成熟的差異顯示逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（DDRT-PCR）法，從相關(guān)
3、基因?qū)哟翁接懗Ｒ娚嗵Πl(fā)生、發(fā)展、變化的機(jī)制，探尋其分子生物學(xué)基礎(chǔ)，豐富舌苔診斷的內(nèi)容，全面認(rèn)識舌苔產(chǎn)生的本質(zhì)、完善中醫(yī)舌苔理論、指導(dǎo)臨床的診斷治療、促進(jìn)中醫(yī)診斷的客觀化、定量化、規(guī)范化。1對象與方法1.1標(biāo)本來源病理舌苔受檢者均系中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診及住院病人，病種不限，但注意各組病種分布的平衡；正常組選擇無全身各系統(tǒng)器質(zhì)性病變，并排除近月內(nèi)舌、口、鼻、咽等局部病變，舌質(zhì)淡紅、舌苔白而潤者。參考《中醫(yī)診斷學(xué)》舌診標(biāo)準(zhǔn)辨舌苔[5]，分為4組：正常薄白苔組10例，其中男6例，女4例，年齡33~52歲；病理薄苔組10例，男4例，女6例，
4、年齡38~55歲；厚苔組10例，男7例，女3例，年齡46~63歲；剝苔組10例，男5例，女5例，年齡45~67歲。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組性別、年齡分布無顯著性差異。80例進(jìn)行臨床驗(yàn)證：正常薄白苔組20例，男10例，女10例，年齡38~55歲；病理薄苔組20例，男11例，女19例，年齡43~56歲；厚苔組20例，男7例，女13例，年齡36~58歲；剝苔組20例，男9例，女11例，年齡46~61歲。兩次研究對象組間性別、年齡分別比較，無顯著差異（P>0.05）。5每個觀察對象用經(jīng)高溫高壓消毒的絲瓜絡(luò)用力刮取舌背中部（花剝苔者取無舌苔覆蓋
5、部位）舌苔，裝于有預(yù)冷生理鹽水（含0.1%DEPC）的10mL具塞離心管中，洗滌、涂片后-70℃密閉保存?zhèn)溆谩?.2總RNA的抽提取冷藏標(biāo)本1mLTrizol試劑（美國GIBCOBRL公司）中快速電動勻漿，按廠家提供說明抽提組織總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA質(zhì)量，紫外分光光度儀測定濃度及純度，總RNA的A260/A280比值在19~20之間。1.3熒光差異顯示熒光差異顯示試劑盒（mRNAprofileKit、fluoroDDKit購自美國Beckman公司）。1.3.1逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將取四組樣品的總RNA，稀釋至0.5g/L，取2LR
6、NA，加2L2mol/L的3′錨式引物，70℃溫育5min，在冰上快速冷卻。加入2Ll250mol/LdNTP，2L100mmol/LDTT，4L5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，7.8L無RNA酶水，0.2L200U/L逆轉(zhuǎn)錄酶（美國GIBCOBRL公司），42℃溫育5min，50℃溫育50min。72℃溫育15min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，-20℃保存?zhèn)溆谩?.3.2PCR反應(yīng)0.95L水，1L10×PCR緩沖液，1.5L25mmol/LMgCl2，2L250mol/LdNTP，1.75L2mol/L5′隨機(jī)引物，0.7L5mol/L熒光素標(biāo)記的3′錨式引
7、物，2L逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，0.1L5U/LTaq酶（GIBCOBRL），在PCR儀上進(jìn)行如下反應(yīng)：95℃2min；94℃30s，50℃40s，72℃2min，共4個循環(huán)；94℃30s，60℃40s，72℃2min，共30個循環(huán)；72℃延伸7min；保存在4℃。PCR產(chǎn)物上樣于5.6%的聚丙烯酰胺凝膠，在GenomyxLR電泳儀上進(jìn)行垂直高壓電泳5h。電泳結(jié)束后50℃干膠15min，然后在在GenomyxSC熒光圖像掃描儀下掃描圖像，比較、確定有差異的cDNA條帶。1.4差異條帶的回收及再擴(kuò)增利用方格圖定位，切取含有差異cDNA條帶的干膠條，
8、浸于50LTE溶液中搗碎，37℃孵育1h。取其中的4L用通用引物M13和T7進(jìn)行再擴(kuò)增。二次PCR反應(yīng)體系為189L水，4L10×PCR緩沖液，15L25mmol/LMgCl2，32L250mol/LdNTP，各4L2m
