蛋白酪氨酸磷酸酯酶4a2基因的克隆、表達及活性鑒定

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1、蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2基因的克隆、表達及活性鑒定程超，郭愛林，巫國勇，吳偉康　羅紅鶴，鐘佛添【摘要】【目的】獲取人蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2（PTP4A2）基因并高效表達純化，對于產(chǎn)物的體外活性進行測定?！痉椒ā坑肦T-PCR技術(shù)，從肝癌細胞系HepG2的總RNA中，獲得編碼PTP4A2基因功能片段的DNA。測序后，通過酶切亞克隆至表達載體ｐGEX-4T-2，構(gòu)建重組表達載體，并導(dǎo)入大腸桿菌E.coliBL21中，IPTG誘導(dǎo)表達重組的GST融合蛋白。對重組融合蛋白過谷胱甘肽瓊脂糖柱進行純化，acia公司

2、；pGEMTeasy載體、RT-PCR試劑盒及Tvector試劑盒、各種限制性內(nèi)切酶、連接酶及TaqDNA聚合酶均為美國Promeca公司產(chǎn)品;DNA酶和高純質(zhì)粒提取試劑盒為德國Qiagen公司產(chǎn)品；IPTG,DTT,DTE,胱胺、谷胱甘肽瓊脂糖及還原性谷胱甘肽,色譜級乙腈，色譜級去離子水，三氟乙酸，芥子酸均為Sigma公司產(chǎn)品;去磷酸化底物多肽R-R-L-I-E-D-A-E-pY-A-A-R-G，美國UBI公司產(chǎn)品，抗GST抗體及arker購自珠海百奧生物技術(shù)有限公司。其余一般化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。表

3、面增強激光解吸電離質(zhì)譜儀（SELDI-TOF-MS）PBSII及金質(zhì)芯片，美國Ciphergen公司制造。1.2RNA的抽提棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，流干。加入適量Trizol裂解細胞，在冰上放置5min；將裂解產(chǎn)物分裝到1.5mL的Eppendof管中，再加入200uL的氯仿，混勻，冰上放置5min；1200×g離心15min，吸上清液于另一離心管中，加入等體積的異丙醇，冰上放置15min。1200×g離心15min，沉淀RNA去上清，體積分數(shù)70％乙醇洗滌沉淀，室溫風(fēng)干，加DEPC處理雙蒸水溶解。10g/

4、L瓊脂糖凝膠檢測質(zhì)量，隨后用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度，置于-70℃冰箱中備用。1.3PTP4A2基因的擴增以提取的RNA為模板進行RT-PCR,擴增PTP4A2全長的ｃDNA編碼片段，引物序列如下：5′端引物：ggatccATGAACCGTCCAGCCC，3′端引物：ctcgagCTACTGAACACAGCAATGCC。48℃50min反轉(zhuǎn)錄。首先于94℃變性5min；然后92℃，30s；56℃，30s；72℃，60s共循環(huán)30次；最后1次循環(huán)完成后于72℃延伸5min。1.4RT－PCR產(chǎn)物

5、的克隆與鑒定回收RT－PCR產(chǎn)物,與質(zhì)粒pGEMTEasy進行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5а,挑取白色菌落進行酶切鑒定,所獲陽性克隆命名為pGEMPTP4A2,送至上海生工公司進行測序。經(jīng)BamHⅠ,XhoⅠ雙酶切后與經(jīng)同樣酶切的pGEX-4T-2進行連接反應(yīng),挑選的陽性克隆命名為pGEXPTP4A2。1.5目的蛋白的誘導(dǎo)表達工程菌在含氨芐青霉素(100ｍｇ/L)的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，按10%的接種量進行轉(zhuǎn)接，250r/min，37℃搖菌至Ａ600=1.0,加入異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.

6、5mmol/L，37℃繼續(xù)通氣培養(yǎng)4～5h。取1.5mL菌液,10000×ｇ離心30s收集菌體,菌體加入H2O60μL，劇烈振蕩混勻，再加入4×樣品緩沖液20μL，100℃，5min；10000×ｇ離心5min；120g/LSDS－PAGE電泳檢測，預(yù)計相對分子質(zhì)量Mr=45000處有明顯的蛋白表達。大規(guī)模培養(yǎng)細菌，誘導(dǎo)表達目的蛋白，收集菌體，超聲破菌。離心后將上清和沉淀分別制樣，進行SDS－PAGE?？扇艿哪康牡鞍字苯討?yīng)用谷胱甘肽瓊脂糖親和層析柱進行親和層析純化以包涵體形式存在的表達產(chǎn)物。N-十二烷基肌

7、氨酸鈉將沉淀蛋白質(zhì)變性過夜,經(jīng)緩慢透析去除N-十二烷基肌氨酸鈉,令蛋白復(fù)性后,用谷胱甘肽瓊脂糖親和層析柱對目的蛋白進行親和層析純化。抗GST抗體及LGlutathioneSepharose4B加入柱子中,用10倍體積的PBS洗去保護液至柱體平衡,柱體平衡后,分別加入15mL的表達液(調(diào)節(jié)流量為0.15mL/min過柱,UV280nm、UV215nm監(jiān)測洗脫、吸附情況),使蛋白質(zhì)充分吸附。PBS洗滌層析柱至重新平衡,將PBS更換為超純水洗柱至將目的蛋白洗出。(責(zé)任編輯：admin)1.7表達產(chǎn)物的PTP4A

8、2，用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，測序結(jié)果表明所擴增的PTP4A2與GeneBank公布的序列相符。2.2表達載體的構(gòu)建pGEMPTP4A2經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切后與經(jīng)同樣酶切的pGEX-4T-2進行連接反應(yīng)后,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，挑選的克隆進行雙酶切鑒定,10g/L瓊脂糖電泳顯示約4900bp大小片段的載體片斷和約500bp的目的基因(圖1)。陽性克隆命名為pGEXPTP4A2。2.3重組蛋白在大腸桿菌中的表達與純化將pG