人酪氨酸酶相關蛋白┐2的cdna克隆及表達

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1、人酪氨酸酶相關蛋白┐2的cDNA克隆及表達摘要:目的克隆酪氨酸酶相關蛋白-2（TRP-2）編碼基因，表達TRP-2蛋白.方法從培養(yǎng)的人黑素細胞中提取總RNA，反轉錄成cDNA，通過PCR方法擴增TRP-2編碼基因，克隆至pUC19載體并測序，再亞克隆至谷胱甘肽巰基轉移酶（GST）融合表達載體pGEX-4T-1，轉化大腸桿菌，IPTG誘導表達TRP-2/GST融合蛋白.結果從培養(yǎng)的人黑素細胞中擴增出編碼TRP-2的cDNA，序列測定證實與文獻報道的序列一致;成功構建了GST融合表達載體pGEX-4T-1/

2、TRP-2;表達了TRP-2/GST融合蛋白.結論成功克隆了人TRP-2基因，構建了GST融合表達載體并表達了TRP-2/GST融合蛋白.　　Keyantyrosinasere-latedprotein2（TRP-2）andexpressthecorrespondingpro┐tein.METHODSTotalRNAculturedhu-manpigmentalcellsandmRNAplifytheTRP-2codingre-gion.ThePCRproductidandsequenced，thens

3、ubclonedintovectorpGEX-4T-1.TheTRP-2proteined;FusionexpressingvectorofpGEX-4T-1/TRP-2anTRP-2geneissuccessfullyclonedandTRP-2/GSTfusionexpressingvectorisconstructed.TRP-2/GSTfusionproteiniscorrectlyexpressedinE.coli.　　0引言　　酪氨酸酶相關蛋白-2（tyrosinaserelatedpro-

4、tein-2，TRP-2）DHI-2羧酸轉化過程中發(fā)揮作用.TRP-2是一種胞質抗原與白癜風的病理機制有關，在白癜風、惡性黑素瘤及接受特異性免疫治療而產(chǎn)生色素減退的患者血清中抗TRP-2IgG滴度較高.此外，抗TRP-2自身抗體與TRP-2或酪氨酸酶均可發(fā)生反應，即TRP-2與酪氨酸酶為交叉抗原.因此，克隆并翻譯TRP-2的cDNA序列，可為進一步探索酪氨酸酶與TRP-2的交叉抗原表位及白癜風的發(fā)病機制和治療打下基礎.　　1材料和方法　　1.1材料人黑素細胞系、克隆質粒pUC19、表達質粒pGEX-4T

5、-1和菌株DH5α由第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院皮膚科實驗室保存;總RNA提取試劑盒購于華美公司;BamHI，EcoRI，T4DNA連接酶購于TaKaRa公司;TaqDNA聚合酶，反轉錄試劑盒、膠回收試劑盒購于Promega公司;谷胱甘肽巰基轉移酶（GST）純化試劑盒購于CloneTech公司.　　1.2方法根據(jù)載體多克隆酶切位點及TRP-2的序列，設計引物.其中引物5’端中引入BamHI酶切位點，3’端引入EcoRI酶切位點.引物由北京SBS公司合成，引物的序列為（下劃線為酶切位點）:p15’CG---GGA

6、TCC---ATGGGCTATAATTGTGGAGACTGCA3’p25’CG---GAATTC---GGCAAAGTTCCAGTAGGGCAAA3’;　　按試劑盒說明書方法操作，從培養(yǎng)的人黑素細胞中提取總RNA，將mRNA反轉錄合成cDNA.目的基因片段常規(guī)PCR擴增，反應條件為:95℃預變性2min后加入TaqDNA聚合酶1U，按94℃30s，55℃30s，72℃40s，進行35個循環(huán)，最后在72℃延伸10min.以HPV重組質粒為反應體系的陽性對照，三蒸水為空白對照，以TRP-1重組質粒為陰性對照

7、.PCR產(chǎn)物進行12g・L-1瓊脂糖電泳，檢測擴增產(chǎn)物片段的大小.產(chǎn)物經(jīng)回收后，以BamHI，EcoRI雙酶切，回收目的片段后定向插入經(jīng)同樣雙酶切的pUC19載體中，以T4DNA連接酶連接.重組后的質粒轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，提取質粒后以BamHI，EcoRI雙酶切，12g・L-1瓊脂糖電泳鑒定.重組質粒由上海生工生物工程公司完成測序.目的基因片段的亞克隆:將測序后的重組載體以BamHI，EcoRI雙酶切，切下的片段插入經(jīng)同樣雙酶切的pGEX4T-1載體中，轉化感受態(tài)細胞

8、DH5α.TRP-2與GST融合蛋白的誘導表達:加入終濃度為0.4mmol・L-1的IPTG，于37℃分別誘導培養(yǎng)2，3和4h，按常規(guī)方法收菌，進行SDS-PAGE.用薄層掃描儀分析該蛋白占菌體總蛋白的含量［1］.表達蛋白的可溶性鑒定:以超聲波破碎細胞，收集表達菌體后，分別取相同濃度的50μL上清及沉淀，進行SDS-PAGE，觀察表達條帶是在上清中還是在包涵體中.表達蛋白的純化用Clotech公司的GST融合蛋白純化柱，按操作