黑松銀松素合成酶的cDNA克隆及表達研究.pdf

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1、第29卷第2期青島大學(xué)學(xué)報(工程技術(shù)版)Vo1．29No．22014年6月JOURNALOFQINGDAOUNIVERSITY(E&T)Jun．2014文章編號：1006—9798(2014)02—0089—05；DOI：10．133061．1006—9798．2014．02．020黑松銀松素合成酶的cDNA克隆及表達研究楊曉，宋修明，王艷士，李榮貴(1．青島大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東青島266071；2．青島市森林病蟲害防治工作站，山東青島266000)摘要：松萎蔫病是由松材線蟲引起的一種危害性極大的森林病害，為研究黑松對松材線蟲的抗性機制，本文利用RT—PCR技術(shù)對黑松體內(nèi)經(jīng)

2、轉(zhuǎn)錄組分析獲得的與銀松素合成酶mRNA高相似度的序列進行擴增，獲得了銀松素合成酶cDNA，然后將此銀松素合成酶基因(PSL)克隆到表達載體pET一15b上，構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET一15b—PSL，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后構(gòu)建工程菌，通過IPTG誘導(dǎo)，工程菌高效表達重組蛋白，經(jīng)Ni2十螯合柱親和層析得到了純化重組銀松素合成酶。該研究為了解黑松銀松素合成酶的功能及松萎蔫病抗性松樹的培育奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：黑松；銀松素合成酶；cDNA；克??；表達中圖分類號：Q93—331；Q939．118文獻標識碼：A松萎蔫病是世界范圍內(nèi)的毀滅性森林疾病]。該病主要由松褐天牛(Mon

3、ochamusalternatusHope)攜帶松材線蟲(Brsnzc“xylophilus)傳播，不僅危害多種松科植物，而且造成嚴重的經(jīng)濟損失。近年來，對松萎蔫病的研究很多，WangZ等人_2]認為不同樹種對松萎蔫病表現(xiàn)出不同抗性，這與松樹的內(nèi)源抗病物質(zhì)密切相關(guān)。銀松素合成酶(pinosylvinsynthase，PS)能夠以肉桂酰輔酶A為底物合成銀松素，是植物合成抗毒素的一個關(guān)鍵酶。所合成的銀松素是松樹最主要的內(nèi)源殺線蟲物質(zhì)之一]，當(dāng)植物受線蟲入侵或損傷時，其將作為植物防御系統(tǒng)的重要組成部分而產(chǎn)生_4]。S．K．Sepp~nen等人l_5]研究表明，銀松素合成酶的表達可以

4、增強植物對窄蓋木層孔菌(Phellinustremulae)的抗性，提高抵御灰霉菌(Botrytiscinerea)侵染的能力，但目前日本黑松中的銀松素合成酶的具體作用尚不清楚。本課題組前期對黑松進行了轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)有一段與銀松素合成酶高相似度的mRNA序列，因此，本文通過RT—PCR技術(shù)對銀松素合成酶cDNA序列進行了克隆與表達，以期為進一步研究該基因的功能打下基礎(chǔ)，也為松萎蔫病抗性樹種的培育提供了理論依據(jù)。1材料與方法1．1菌株、質(zhì)粒與試劑實驗所用大腸桿菌E．coliDH5a、E．coliBI21(DE3)及pET一15b，購自美國Novagen公司；質(zhì)粒pMD～18T

5、為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；總RNA提取試劑盒、RT—PCR試劑盒及PCR擴增試劑為康維世紀公司產(chǎn)品。1．2黑松愈傷組織的培養(yǎng)將黑松種子放于50mI的小燒杯中，在流水下沖洗干凈。將沖洗干凈的黑松種子在超凈工作臺輕剝其外殼，置于事先用酒精擦拭過的空皿中，倒入適量的75乙醇溶液進行消毒處理，每次30S，共進行3次，接著用0．19／5的升汞溶液處理5rain，最后用無菌水沖洗6次。在超凈工作臺上剝除經(jīng)消毒處理后黑松種子的收稿日期：2Ol3—12—31：修回日期：2014一O1一O5基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(31070575)；青島市科技發(fā)展計劃項目(12—1—4—2一(

6、1)一jch，12一l一3—46一nsh)作者簡介：楊曉(1989一)，女，碩士研究生，主要研究方向為病原微生物的檢測與控制。通訊作者：李榮貴(1969一)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師。Email：lrg@qdu．edu．cn9O青島大學(xué)學(xué)報(工程技術(shù)版)第29卷胚乳，然后選取完整的胚接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)8～l0d，誘導(dǎo)黑松愈傷組織的形成。選取細胞分裂快、結(jié)構(gòu)疏松且未褐變的愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基上進行傳代培養(yǎng)[7。1．3引物設(shè)計與合成根據(jù)黑松轉(zhuǎn)錄組中銀松素合成酶的mRNA序列，利用DNAman軟件設(shè)計一對引物：引物1：5’一AAACATATGGGGG

7、GCGTTGATTTTGAAG一3’引物2：5’一AAACTCGAGCTAAAGAGGAACGCTCTTG一3’引物l和引物2分別含有NdeI和XhoI限制性酶切位點，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。1．4黑松愈傷組織總RNA的提取及RT—PCR將新鮮的未褐變的黑松愈傷組織置于預(yù)冷的研缽，經(jīng)液氮充分研磨成粉狀，按照康維世紀公司植物總RNA提取試劑盒說明書獲得總RNA提取液，并通過瓊脂糖凝膠電泳和吸光度測定判斷提取獲得的總RNA的質(zhì)量和濃度。然后按照康為世紀公司RT—PCR試劑盒提供的操作流程