資源描述：
《熒光假單胞菌鞭毛蛋白對黑松細胞作用的轉錄組分析及黑松銀松素合酶基因的克隆與表達》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在學術論文-天天文庫。
1、摘要松材線蟲攜帶的熒光假單胞菌(PseudomonasfluorescensGcM5．1A)的鞭毛蛋白會引起黑松(Pinusthunbergii)細胞非典型性凋亡，為了從mRNA水平研究鞭毛蛋白對于黑松細胞的影響機制，本文使用鞭毛蛋白及去離子水分別處理黑松愈傷組織，通過Illuminasolexa測序技術對兩組樣本進行轉錄組分析，進一步利用RT-PCR技術克隆從黑松體內(nèi)獲得的經(jīng)轉錄組分析得出的與銀松素合成酶mRNA高相似度的序列，并進行表達純化。結果表明：通過將轉錄組數(shù)據(jù)與GO數(shù)據(jù)庫進行功能比對，
2、共有29，475個轉錄本比對到功能分支上，這些功能包括生物學過程、細胞組分和分子功能。通過對兩樣本進行轉錄組差異表達水平分析，得到差異表達顯著的轉錄本1779個，并對其進行進一步GO分類和KEGG分析，共富集到286個GO功能分支以及11個代謝途徑上。通過對轉錄組數(shù)據(jù)的上述分析，發(fā)現(xiàn)在黑松體內(nèi)存在的一些與抗病有關的基因在鞭毛蛋白的作用下顯著上調(diào)，包括以下基因編碼的酶，如蔗糖合酶、銀松素合酶、幾丁質(zhì)酶、Q．淀粉酶／枯草桿菌蛋白酶抑制劑、苯丙氨酸氨裂解酶、4．香豆酸輔酶A連接酶、過氧化物酶、WRKYl
3、、PR5和PRIO等。通過RT-PCR技術從黑松體內(nèi)克隆獲得了銀松素合成酶cDNA，將此序列克隆到表達載體pET-15b上，構建pET-15b．PLS表達載體，轉化EcoliBL21(DE3)構建工程菌，經(jīng)異丙基．D．D．硫代半乳糖苷(IPTG)誘導，重組銀松素合成酶在工程菌中得到高效表達，通過Ni2+螯合柱親和層析得到純化重組蛋白。本課題從轉錄組水平研究了熒光假單胞菌鞭毛蛋白對于黑松細胞的作用機制，并鑒定出黑松體內(nèi)對鞭毛蛋白敏感的基因，為研究鞭毛蛋白對黑松的致病機理創(chuàng)造條件，純化蛋白的獲得將為該
4、蛋白功能的研究及松萎蔫病抗性樹種的培育打下了基礎。關鍵詞：鞭毛蛋白；黑松；轉錄組學；銀松素合成酶；克??；表達AbstractIlluminasolexasequencingwasperformedinthisstudytocharacterizethetranscriptomeofPinusthunbergiiandidentifycandidategenesthatrespondtotreatmentofflagellinsecretedbyPseudomonasfluorescensGeM5-
5、1Aassociatedwithpinewoodnematode(PWN)．Atotalof29，475isoformsWereobtainedfromflagellintreatedanduntreatedPthunbergiicalluscellsandwereassignedGOtermsbasedontheirinvolvementinbiologicalprocesses，cellularcomponentsand／ormolecularfunctions．Comparisonofexp
6、ressionprofilesoftheflagellintreatedanduntreatedsamplesshowed1,779significantlydifferentiallyexpressedisoforms．AfterGOandKEGGenrichmentanalysesofsignificantlydifferentiallyexpressedisoforms，286enrichedGOisoformsand1lenrichedpathwayswereobtained．Expres
7、sionofsomegenesthatplayanimportantroleindiseaseresistancewasfoundtobeup-regulatedinpinecellschallengedwithflagellin．Theseincludechitinase，a-amylasesubtilisininhibitor,lipoxygenasel，CoAligase，peroxidase，sucrosesynthase，pinosylvinsynthase，phenylalaninea
8、mmonialyase，WRKY1，PR5andPRl0．Inthisstudy,wehaveprovidedthegeneticarchitectureofthePthunbergiitranscriptome，andidentifiedcandidategenespotentiallyregulatedbyflagellin，whichwillfacilitatefurtherunderstandingoftherolesofflagellininpinewiltdisease
