資源描述：
《熒光假單胞菌gcm5-1a過氧化物還原酶與黑松的過氧化物酶的基因克隆及其活性研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、摘要過氧化物還原酶家族(Peroxiredoxins，Prxs)是抗氧化酶家族成員，廣泛存在于各種生物體內(nèi)，是一類能降解烷基氫過氧化物和過氧化氫的一類無亞鐵血紅素過氧化物還原酶。本研究從松材線蟲體表的熒光假單胞菌GcM5．1A克隆出一個639bp的完整基因，編碼一個由213個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。氨基酸序列同源性比對發(fā)現(xiàn)，目的蛋白的氨基酸序列分別與nP材如瓏D力娜．_7z甜D，囂cP邶Q2．87的硫醇特異性抗氧化蛋白tLsfA有99％的同源性，與Pseudomonassp．GMl7的過氧化物還原酶有97％的同源性，與PseudomonasfluorescensPf0．1的1．半胱氨酸過氧
2、化物還原酶有97％的同源性。將完整的開放閱讀框克隆到表達(dá)載體pET-15b，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-15b．1．Cys-Prx，并轉(zhuǎn)化西如∥紀(jì)觸7coliBL21(DE3)，擴大培養(yǎng)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，利用鎳離子瓊脂糖凝膠親和層析純化得到27kDa的重組蛋白。非變性SDS．PAGE分析發(fā)現(xiàn)重組蛋白有部分是以二聚體形式存在的。通過活性分析發(fā)現(xiàn)重組蛋白同時具有過氧化物還原酶和硫氧還蛋白活性。研究發(fā)現(xiàn)含有重組表達(dá)質(zhì)粒的工程菌明顯增強了對過氧化氫壓力的耐受性。另外，本研究采用RT-PCR的方法，從黑松愈傷組織中獲得過氧化物酶cDNA，其開放閱讀框全長981bp，編碼326個氨基酸殘基。將該開放
3、閱讀框克隆到表達(dá)載體pET-15，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-15b．POD，轉(zhuǎn)化E．coliBL21(DE3)構(gòu)建工程菌，IPTG誘導(dǎo)工程菌高效表達(dá)過氧化物酶，通過Ni2+螯合親和層析得到了大小約為38kDa重組過氧化物酶。生物信息學(xué)分析表明，該蛋白具有植物過氧化物酶的典型結(jié)構(gòu)，以及具有過氧化物酶家族保守的活性位點?；钚苑治霰砻髟摰鞍椎拇_是黑松過氧化物酶，該研究為松萎蔫病抗性機理的研究奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：熒光假單胞菌GcM5．1A；1．半胱氨酸過氧化物還原酶；黑松；過氧化物酶；克?。槐磉_(dá)AbstractPeroxiredoxins(Prxs)areenzymaticantioxidant
4、swidelydistributedinbiologicalkingdoms，whichconstituteafamilyofheme-freeperoxidasesthatreducealkylhydroperoxidesandhydrogenperoxide．Inthispaper,anopenreadingframeof639bp，whichencodedaproteinof213aminoacidresidues，wasclonedfromPseudomonasj'CluorescensGeM5—1Acarriedbypinewoodnematode．Aminoacidsequ
5、encealignmentshowedthattheencodedproteinsharedasimilarityof99％，97％and97％identity、Ⅳimthethiol-specificantioxidantproteinLsfAofPfluorescensQ2-87，theperoxiredoxinofPseudomonassp．GMl7and1-CysperoxiredoxinofPfluorescensPf0—1，respectively．TheORFWasclonedintoexpressingvectorpET-15btoconstructrecombinan
6、tplasmidpET-15b一1一Cys—PrxwhichWasintroducedintoinEscherichiacoliBL21(DE3)．Overexpressionofa27kDaproteinWasachievedbyIPTGinduction．TherecombinantproteinWaspurifiedbyaffinitychromatographyonaNipmatrixcolumn．Non-reducingSDS—PAGEanalysisindicatedthatpartoftherecombinantappearedindimerform．Bioassayre
7、sultsshowedthatpurifiedrecombinantproteinhadbothperoxidaseandthioredoxinactivity．EcoliharboringtheORFshowedtolerancetohydrogenperoxidestress．Inaddition，aperoxidaseeDNAcontainingopeningreadingflameof981bpandencodingapeptideof
