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1、熒光假單胞菌工程菌株的構(gòu)建摘要:采用基因工程的方法，將含有2,4DAPG基因的質(zhì)粒pM0N5122導(dǎo)入到野生型熒光假單胞菌株中，探索了不同熱激時間、不同CaC12濃度和熒光假單胞菌的不同生長時期對轉(zhuǎn)化子形成的影響；結(jié)果表明，熒光假單胞菌生長到0D約0.53時，用0.025mol/LCaC12處理細胞，熱激3?4min,轉(zhuǎn)化頻率最高；關(guān)鍵詞:熒光假單胞菌;工程菌株;代謝產(chǎn)物;生物農(nóng)藥焚光假單胞菌(Pscudomonasfluorcsccns)是植物根圍和土壤中常見的一種有益細菌，分布廣泛，易于繁殖。對植物病害，尤其是土傳病害如
2、猝倒?。?］、根腐?。?］、枯萎?。?］等均有很好的防治作用，是重要的有益微生物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有非常重要的意義。利用熒光假單胞菌防治植物病害的機制包括競爭鐵元素和其他營養(yǎng)物質(zhì)、主態(tài)位排斥作用(Nicheexclusion)、誘導(dǎo)植物產(chǎn)蟲系統(tǒng)抗性，以及產(chǎn)生拮抗微生物的代謝產(chǎn)物等。抗生作用一直以來都被認為是假單胞菌類生防作用的重耍方面。2,4DAPG是熒光假單胞菌產(chǎn)生的一種具有抗真菌、抗細菌作用的酚類代謝產(chǎn)物，在抑制多種土傳植物病害中占有重要地位，如它對防治由小麥全蝕病菌引起的小麥全蝕病起著重要作用。為提高生防效果，擴大生防范
3、圍，更加有效地防治蔬菜等某些土傳病害，我們進行了熒光假單胞菌工程菌株的構(gòu)建。試圖通過增加DAPG合成基因拷貝數(shù)的途徑,來提高菌株的生防效果。工程菌株對黃瓜枯萎病的防治效果超過了野生菌株,為進一步研宄一種新型、高效的生物農(nóng)藥奠定了基礎(chǔ)。一.材料和方法1.培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基:蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCllOg,蒸餾水lOOOmL,pH7.5。選擇培養(yǎng)基:在LB培養(yǎng)基中加入四環(huán)素至終濃度25ug/mL。沙-玉米粉培養(yǎng)基:沙98份,玉米粉2份,水少許。2.質(zhì)粒的提取、純化和檢測采用堿裂解法提取質(zhì)粒，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。3.
4、熒光假單胞菌感受態(tài)細胞的制備將熒光假單胞菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，于28°C振蕩培養(yǎng)過夜，以1%的接種量轉(zhuǎn)接于10mL新鮮的LB培養(yǎng)液中，于28°C,240r/min振蕩培養(yǎng)至0D約0.53,冰浴30min，離心收集菌體，加入5mL預(yù)冷的0.025mol/LCaC12處理2h,離心，菌體用ImL預(yù)冷的0.025mol/L的CaC12懸浮備用。二.轉(zhuǎn)化反應(yīng)將1?2uL（約1ug）pM0N5122質(zhì)粒DNA與200PL感受態(tài)細胞混勻，冰浴放置30min,42°C熱激3min,冰浴中放置5min,加入800uLLB液體培養(yǎng)基，振蕩
5、培養(yǎng)lh，按每皿100uL涂布于含四環(huán)素的平板上,28°C培養(yǎng)約40h,挑取抗性菌落進行純培養(yǎng)。三.轉(zhuǎn)化條件研宄在以上方法的基礎(chǔ)上，分別改變CaC12濃度、熱激時間和熒光假單胞菌生長時期研宄不同條件對轉(zhuǎn)化子形成的影響。.結(jié)果與分析工程菌的構(gòu)建及鑒定工程菌株的構(gòu)建策略，將PM0N5122質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)化方法克隆入熒光假單胞菌感受態(tài)細胞中，根據(jù)克隆子的四環(huán)素抗性篩選出在四環(huán)素平板上生長的轉(zhuǎn)化子。提取陽性重組子中的質(zhì)粒pM0N5122,用HindIII和EcoRI進行雙酶切后，產(chǎn)生2個片斷,大小分別為1015kb（與載體PRK415大
6、小相同）和6.5kb,其中的小片段為DAPG合成基因表明DAPG合成基因己經(jīng)導(dǎo)入熒光假單胞菌野生菌株中。CaC12濃度對轉(zhuǎn)化頻率的影響Ca2+在低溫吋可以使細胞壁的通透性及細胞表面的正電荷增加，這些改變有利于DNA的吸附和吸收。本試驗用不同濃度的CaC12即0.020,0.025,0.030和0.040mol/L處理熒光假單胞菌細胞，結(jié)果表明3用0.025mol/LCaC12處理熒光假單胞菌細胞轉(zhuǎn)化頻率最高,0.040mol/LCaC12處理轉(zhuǎn)化頻率最低，隨著CaC12濃度的提高，轉(zhuǎn)化頻率呈現(xiàn)升高一降低的變化趨勢,濃度超過0
7、.025mol/L時，轉(zhuǎn)化頻率急速下降。熱激時間對轉(zhuǎn)化頻率的影響本試驗在42°C時分別處理l，2,3,4min，目的在于促進熒光假單胞菌對DNA的吸收，熱激時間直接影響轉(zhuǎn)化子的形成，結(jié)果表明，處理1,2min時,沒有轉(zhuǎn)化子形成，處理3,4min時,轉(zhuǎn)化頻率較高.生長時期對轉(zhuǎn)化頻率的影響細菌的生長時期直接影響感受態(tài)細胞的建立。取不同生長時期的熒光假單胞菌，用0.025mol/LCaC12處理進行轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明，在0D約0.53時，轉(zhuǎn)化頻率最高,0D大于或小于0.53時，轉(zhuǎn)化頻率均表現(xiàn)為下降趨勢。五、討論大多數(shù)細菌轉(zhuǎn)化方法都依據(jù)
8、Mandel和Higa在1970年的發(fā)現(xiàn)[9],首先用冰預(yù)冷的CaC12溶液處理細菌然后作短暫的熱處理，該處理方法改變了細胞膜的結(jié)構(gòu)，在受體細胞中誘導(dǎo)了一種短暫的“感受態(tài)”，使質(zhì)粒DNA能夠穿過細菌細胞膜進入細胞，因此，CaC12的濃度和熱處理時間對質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌時
