熒光性假單胞菌抗性基因的篩選

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1、熒光性假單胞菌抗性基因的篩選實驗背景熒光假單胞菌可產(chǎn)生10多種具有抗菌作用的抗生性次級代謝產(chǎn)物藤黃綠膿菌素【Plt】硝吡咯菌素【Prn】2，4-二乙?；冱S酚【Phl】生物表面活性劑（環(huán)脂肽【CLP】、鼠李糖脂）嗜鐵素(水楊酸、綠膿桿菌螯鐵蛋白、青膿素)卵菌素A氫氰酸鄰氨基苯甲酸隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，從分子水平對藤黃綠膿菌素(Plt)、2，4-二乙酰基藤黃酚(Phl)、硝吡咯菌素(Prn)、環(huán)脂肽(CLP)等抗生性次級代謝產(chǎn)物的合成機制進行了深入研究，與其相關(guān)的功能基因已經(jīng)被鑒定。本實驗設計了針對特定基因的引物，利用PCR技術(shù)，

2、篩選可以產(chǎn)生藤黃綠膿菌素(Plt)、2，4-二乙?；冱S酚(Phl)、硝吡咯菌素(Prn)、環(huán)脂肽(CLP)的熒光性假單胞菌實驗流程一，實驗準備1，配置LB培養(yǎng)基，滅菌2，96孔板清洗干凈，包好滅菌3，移液器槍頭（1mL，200uL，10uL），0.2mLPCR管，1.5mlEP管，包好滅菌4，去離子水，滅菌二，熒光性假單胞菌菌種的活化1，在96孔板的每個孔中加入540μlLB培養(yǎng)基2，接入60μl甘油菌注意：這一步要做好記錄，記清楚每個孔中接入的是那一株菌種注意：每一組學生接種一支陽性菌株P(guān)f-53，將接過菌的96孔板置于28℃

3、搖床過夜培養(yǎng)注意：96孔板需固定好，防止傾斜導致菌種交叉污染接種記錄表格123456789101112APf-5BCDEFGH三，菌落PCR所用引物a.環(huán)脂肽CLP:(1)PGPRB-4965/PGPRB-4966(2)PGPRB-5045/PGPRB-5046b.2,4-乙酰藤黃酚Phl:Phl2a/Phl2bc.硝吡咯菌素Prn:Prnd1/Prnd2d.藤黃綠膿菌素Plt:PltC1/PltC2三，菌落PCRPCR體系:20ul滅菌去離子水15.2ul10×buffer2uldNTP0.8ul上游引物0.4ul下游引物0.4

4、ulTaq酶0.2ul模板1ul以8個樣品、1個陽性對照（Pf-5）和1個陰性對照為例的MIX×10PCRH2O15.2ul152ul10×buffer2ul20uldNTP0.8ul8ul上游引物0.4ul4ul下游引物0.4ul4ulTaq酶0.2ul2ul在EP管中加入試劑后，分裝入10個PCR管中，19ul/管，其中1管作為陰性對照，1管作為陽性對照，加入1uLPf-5菌液作為模版，剩下8管分別加入1ul模板菌落PCR實驗流程根據(jù)各組所做的模板數(shù)目計算mix，依次加入除模板之外的各試劑后混勻，離心，分裝19uL入PCR管

5、，對PCR管進行編號將活化好的菌液取100uL按照編號從96孔板分別移到1.5mLEP管中，蓋緊蓋子，置于沸水中煮10分鐘。離心，各取1uL作為模板加入PCR管中將PCR管放入設好程序的PCR儀中運行四，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果1，配置1%的瓊脂糖凝膠稱取0.8g瓊脂糖，加入80mL1xTAE緩沖液，置于電爐上煮沸3次，冷卻至不燙手時加入40uL的EB染料，搖勻，倒入膠板。放置梳子（注意選擇足夠孔數(shù)的梳子）。靜置30-40min待凝膠冷卻。2，點樣，電泳將凝膠移入電泳槽，電泳槽中應該有充足的1xTAE緩沖液。PCR產(chǎn)物中加入2

6、uL10x上樣緩沖液，混勻，離心。每孔依次點樣4uL，記錄每孔點入的樣品編號。每一塊凝膠的一個孔需加入4uLPf-5PCR產(chǎn)物作為對照。120V電泳30min3，結(jié)果凝膠成像記錄電泳結(jié)果12—12—12—MprnphlpltPrn：786bpPhl：745bpPlt：438bp。CLPPGPRB-4965/PGPRB-4966360bpPGPRB-5045/PGPRB-5046960bp五，整理實驗結(jié)果并進行菌種的保藏記錄并整理PCR結(jié)果陽性的編號相應編號的菌株需進行保藏撰寫實驗報告，附實驗結(jié)果記錄表格（每個小組撰寫一份報告）序號

7、菌種編號4965/49665045/5046phlprnplt1XXX++———2XXX——+——實驗結(jié)果記錄表格