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《銅綠假單胞菌氨基糖苷類耐藥基因的研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、萬(wàn)方數(shù)據(jù)溫州醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯委員會(huì)主席：塑松生答辯委員會(huì)成員：里主渲匿筮韭萬(wàn)方數(shù)據(jù)溫州醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文目錄j}爸：；ej·-·········································································1中文摘要??··???·???·?????????????··1英文摘要???????????????????????3縮略詞表???????????????????????6前言???????????·??????????·???·7材料與方法??????????????????????11結(jié)
2、果?????????????????????????23分析與討論??????????????????????37，J、結(jié)?????????????????????????40參考文獻(xiàn)???????????????????????41附錄?????????????????????????42致謝?????????????????????????47綜述?????????????????????????48綜述參考文獻(xiàn)?????????????????????54獨(dú)創(chuàng)性聲明??????????????????????58萬(wàn)方數(shù)據(jù)溫州醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文銅綠假單胞菌氨基糖苷類耐
3、藥基因的研究中文摘要目的：本文應(yīng)用高通量測(cè)序以及基因組生物信息分析，以臨床分離的不同年份的銅綠假單胞菌(PA)為研究對(duì)象，研究已經(jīng)報(bào)道過(guò)的所有氨基糖苷類耐藥基因在PA中的分布情況；并發(fā)掘PA中氨基糖苷類耐藥新基因型，克隆候選基因，通過(guò)藥敏試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證新基因型的功能。進(jìn)一步對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為銅綠假單胞菌所攜帶的耐藥基因分布規(guī)律、傳播機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。方法：本課題以溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床分離得到的239株P(guān)A為樣本，提取其混合基因組，并送至北京中科院基因組研究所進(jìn)行solexa測(cè)序。通過(guò)一系列生物信息學(xué)工具，將測(cè)序得到的短序列與收集到的151條己報(bào)道氨基糖苷類耐
4、藥基因序列比對(duì)分析，研究這151條氨基糖苷類耐藥基因在PA中的分布情況及豐度差異。同時(shí)進(jìn)一步發(fā)掘新的耐藥基因型，選取其中的aadA4基因型為代表，設(shè)計(jì)引物PCR定位該基因所在的菌株。PCR篩選出的陽(yáng)性菌株中的aadA4基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息分析，研究該基因的同源性和分子進(jìn)化。將aad,44新基因型片段連接到T載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JMl09，提取重組子質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，再將片段連接到pET-15b載體，轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌大腸桿菌BL21，涂布于含Amp平板上進(jìn)行培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性菌株pET：：aadA4／BL21。然后通過(guò)瓊脂倍比稀釋法測(cè)定pET：：aadA4／BL21對(duì)17種藥物的M
5、IC值，來(lái)驗(yàn)證銅綠假單胞菌中aadA4新基因型的功能。同時(shí)藥敏試驗(yàn)也研究了選取的45株銅綠假單胞菌對(duì)17種藥物的MIC值，觀察該院分離的銅綠假單胞菌的對(duì)抗生素的耐藥性情況以及分析aadA4基因陽(yáng)性株與陰性株耐藥性的差異。結(jié)果：1．銅綠假單胞菌混合基因組高通量測(cè)序結(jié)果產(chǎn)生的短序列reads總數(shù)有70，239，195條，reads的長(zhǎng)度均為100nt。將reads比對(duì)到151條氨基糖苷類耐藥基因序列上，最后發(fā)現(xiàn)有25個(gè)基因型存在于銅綠假單胞菌中。其中豐度最高的基因型為aphO=)．冊(cè)，豐度有1636．218X，覆蓋度99．88％；豐度最低的基因型是aad,412，豐度有2．2X
6、，覆蓋度80．1％。萬(wàn)方數(shù)據(jù)溫州醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文2．從239株銅綠假單胞菌中，PCR篩選出兩株菌TLl229、TLl285，包含有aadA4基因型，其余銅綠假單胞菌均不含aadA4基因型。3．PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果分析，TLl229與TLl285中的aadA4基因型比對(duì)identity為100％，TLl229、TLl285中的aadA4基因型與參照序列aadA4比對(duì)identity為95％，且發(fā)生了氨基酸水平的差異。4．a(chǎn)adA4新基因型進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)與大腸桿菌中的YP190214蛋白親緣關(guān)系最近，銅綠假單胞菌中aadA4基因的來(lái)源可能是由大腸桿菌水平轉(zhuǎn)移而來(lái)。5．成
7、功將aadA4基因連接到pET．15b表達(dá)載體，并成功構(gòu)建表達(dá)目的重組菌pET：：aadA4／BL21。6．MIC功能驗(yàn)證，TLl229、TLl285中發(fā)現(xiàn)的aadA4新基因型對(duì)鏈霉素、大觀霉素和新霉素的MIC值比對(duì)照組高出4個(gè)濃度梯度左右，對(duì)其他抗生素則沒(méi)有明顯的作用。7．醫(yī)院分離的銅綠假單胞菌對(duì)鏈霉素、大觀霉素、核糖霉素、頭孢唑啉鈉、氨芐西林鈉和替卡西林具有很強(qiáng)的耐藥作用，MIC值達(dá)到了1024pg／mL以上。TLl285、TLl185、TLl208、TLl288、TLl289這五株菌幾乎對(duì)所有的藥物MIC都很
