熒光假單胞菌鞭毛蛋白對(duì)黑松細(xì)胞作用的轉(zhuǎn)錄組分析及黑松銀松素合酶基因的克隆與表達(dá)

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1、摘要松材線蟲攜帶的熒光假單胞菌(PseudomonasfluorescensGcM5．1A)的鞭毛蛋白會(huì)引起黑松(Pinusthunbergii)細(xì)胞非典型性凋亡，為了從mRNA水平研究鞭毛蛋白對(duì)于黑松細(xì)胞的影響機(jī)制，本文使用鞭毛蛋白及去離子水分別處理黑松愈傷組織，通過Illuminasolexa測(cè)序技術(shù)對(duì)兩組樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，進(jìn)一步利用RT-PCR技術(shù)克隆從黑松體內(nèi)獲得的經(jīng)轉(zhuǎn)錄組分析得出的與銀松素合成酶mRNA高相似度的序列，并進(jìn)行表達(dá)純化。結(jié)果表明：通過將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能比對(duì)，

2、共有29，475個(gè)轉(zhuǎn)錄本比對(duì)到功能分支上，這些功能包括生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能。通過對(duì)兩樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)水平分析，得到差異表達(dá)顯著的轉(zhuǎn)錄本1779個(gè)，并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步GO分類和KEGG分析，共富集到286個(gè)GO功能分支以及11個(gè)代謝途徑上。通過對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的上述分析，發(fā)現(xiàn)在黑松體內(nèi)存在的一些與抗病有關(guān)的基因在鞭毛蛋白的作用下顯著上調(diào)，包括以下基因編碼的酶，如蔗糖合酶、銀松素合酶、幾丁質(zhì)酶、Q．淀粉酶／枯草桿菌蛋白酶抑制劑、苯丙氨酸氨裂解酶、4．香豆酸輔酶A連接酶、過氧化物酶、WRKYl

3、、PR5和PRIO等。通過RT-PCR技術(shù)從黑松體內(nèi)克隆獲得了銀松素合成酶cDNA，將此序列克隆到表達(dá)載體pET-15b上，構(gòu)建pET-15b．PLS表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化EcoliBL21(DE3)構(gòu)建工程菌，經(jīng)異丙基．D．D．硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，重組銀松素合成酶在工程菌中得到高效表達(dá)，通過Ni2+螯合柱親和層析得到純化重組蛋白。本課題從轉(zhuǎn)錄組水平研究了熒光假單胞菌鞭毛蛋白對(duì)于黑松細(xì)胞的作用機(jī)制，并鑒定出黑松體內(nèi)對(duì)鞭毛蛋白敏感的基因，為研究鞭毛蛋白對(duì)黑松的致病機(jī)理創(chuàng)造條件，純化蛋白的獲得將為該

4、蛋白功能的研究及松萎蔫病抗性樹種的培育打下了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：鞭毛蛋白；黑松；轉(zhuǎn)錄組學(xué)；銀松素合成酶；克??；表達(dá)AbstractIlluminasolexasequencingwasperformedinthisstudytocharacterizethetranscriptomeofPinusthunbergiiandidentifycandidategenesthatrespondtotreatmentofflagellinsecretedbyPseudomonasfluorescensGeM5-

5、1Aassociatedwithpinewoodnematode(PWN)．Atotalof29，475isoformsWereobtainedfromflagellintreatedanduntreatedPthunbergiicalluscellsandwereassignedGOtermsbasedontheirinvolvementinbiologicalprocesses，cellularcomponentsand／ormolecularfunctions．Comparisonofexp

6、ressionprofilesoftheflagellintreatedanduntreatedsamplesshowed1,779significantlydifferentiallyexpressedisoforms．AfterGOandKEGGenrichmentanalysesofsignificantlydifferentiallyexpressedisoforms，286enrichedGOisoformsand1lenrichedpathwayswereobtained．Expres

7、sionofsomegenesthatplayanimportantroleindiseaseresistancewasfoundtobeup-regulatedinpinecellschallengedwithflagellin．Theseincludechitinase，a-amylasesubtilisininhibitor,lipoxygenasel，CoAligase，peroxidase，sucrosesynthase，pinosylvinsynthase，phenylalaninea

8、mmonialyase，WRKY1，PR5andPRl0．Inthisstudy,wehaveprovidedthegeneticarchitectureofthePthunbergiitranscriptome，andidentifiedcandidategenespotentiallyregulatedbyflagellin，whichwillfacilitatefurtherunderstandingoftherolesofflagellininpinewiltdisease