假單胞菌NyZ12中環(huán)己胺氧化酶基因的克隆、表達(dá)與純化.pdf

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3、onasplecoglossicidaNyZ12論文作者李存治指導(dǎo)教師閆達(dá)中副教授學(xué)科專業(yè)生物化學(xué)與分子生物學(xué)論文提交日期論文答辯日期答辯委員會主席評閱人2016年5月論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果，除文中己經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含任何其他個人或集體己經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得飯輕工大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。對本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個人或集體均己在文中作了明確的說明并表示謝意。本人完全意識

4、到本聲明的法律責(zé)任和法律后果由本人承擔(dān)。論文作者簽名：簽字日期：年月日論文版權(quán)使用授枚書本學(xué)位論文作者完全了解武漢輕工大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，特授權(quán)龍輕工大學(xué)可レ乂隱學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，并采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存、匯編，供查閣和借閱。同意學(xué)校向國家有關(guān)部口或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)本和電子文件。（保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)說明）Ｉ論文作者簽名：導(dǎo)師簽名：心簽字日期；：年／月日簽字日期養(yǎng)年＾月摘要環(huán)己胺(化學(xué)式C6H13N)

5、又被稱為氨基環(huán)己烷或六氫苯胺，是一種重要的精細(xì)化工中間體，在使用和生產(chǎn)的過程中，環(huán)己胺被釋放到了環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)已證實(shí)該化合物有致癌性。由于環(huán)己胺在工業(yè)生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用和對人體的明顯危害性，有必要采取一定的措施對工業(yè)中產(chǎn)生的廢棄胺進(jìn)行降解；而微生物降解成本低，能耗少，是消除環(huán)己胺對環(huán)境污染和殘留的有效途徑之一。目前報道的以環(huán)己胺為碳氮源生長的純培養(yǎng)物僅有兩株，一株是IwakiH.等人分離篩選到的革蘭氏陽性短桿菌IH-35A，另一株是由中國科學(xué)院武漢病毒研究所周寧一研究組分離的假單胞菌NyZ12。假單胞菌NyZ12是一株

6、可以降解環(huán)己胺的革蘭氏陰性菌。本研究將篩選出的假單胞菌NyZ12進(jìn)行了全基因組測序。通過比對分析，將可能編碼環(huán)己胺氧化酶的基因進(jìn)行克隆表達(dá)，之后運(yùn)用各種實(shí)驗(yàn)方法確定了真正的編碼基因，進(jìn)一步誘導(dǎo)表達(dá)純化該酶，檢測了環(huán)己胺氧化酶的活力。主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下：1.首先研究了野生菌NyZ12的生長情況及降解環(huán)己胺的能力，實(shí)驗(yàn)證明該野生菌可在20h內(nèi)降解10mmol/L的環(huán)己胺，確定了分光光度法檢測環(huán)己胺濃度的的方法。而且通過實(shí)驗(yàn)確定了環(huán)己胺胺氧化酶是受底物誘導(dǎo)型表達(dá)的。2.將全基因組測序結(jié)果通過生物信息學(xué)分析比對，找到五

7、個可能編碼環(huán)己胺氧化酶的候選基因amo2631、amo4207、amo5539、amo0425、amo4637，分別克隆到載體pUC18上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5?中。3.運(yùn)用分光光度法檢測pUC18系列的重組工程菌對底物環(huán)己胺的降解實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明只有DH5??pUC18-2631]能夠降解底物環(huán)己胺，因此初步判斷出了這五個基因中編碼環(huán)己胺氧化酶的一個關(guān)鍵基因是amo2631。4.通過熒光定量PCR研究了這五個基因在底物誘導(dǎo)之后的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)amo2631基因的表達(dá)量明顯上調(diào)，這跟我們做的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果是一致的

8、。進(jìn)一步證明了amo2631很有可能是編碼環(huán)己胺氧化酶的基因。5.為了使目的基因表達(dá)形成可溶性的蛋白并便于純化，將這五個基因加入His標(biāo)簽克隆到pVLT33載體上并轉(zhuǎn)入DH5?中。用氣相方法檢測pVLT33系列的重組工程菌對底物環(huán)己胺的降解情況和產(chǎn)物生成情況，結(jié)果證明只有DH5??pVLT33-2631]氣相檢測到了中間產(chǎn)物環(huán)己酮的生成，證明了amo2631