資源描述：
《銅綠假單胞菌cmcc中青霉素結合蛋白-的克隆表達和純化.》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在教育資源-天天文庫。
1、由于抗生素可用于治療各種感染性疾病，有的人就將抗生素作為萬能藥，不管得了什么病，都用抗生素治療。要知道，濫用抗生素，可引起許多不良的后果。因此強調合理使用抗生素，重視抗生素的毒副作用是很有必要的。那么，該如何合理使用抗生素呢？（1）病毒性疾病不宜用抗生素治療。上呼吸道感染以及咽痛、咽峽炎，大部分是病毒感染所致，因此這類疾病無需抗生素而應使用病毒靈、病毒脞等抗病毒藥物以及中草藥治療。（2）應根據(jù)細菌培養(yǎng)和藥敏試驗結果選用抗生素。但如果受條件限制或病情危急，亦可根據(jù)感染部位和經(jīng)驗選用，然而可靠性較差。一般情況下，呼吸道感染以革蘭氏陽性球菌為多見。尿道和膽道感染以革蘭氏陰性
2、菌為多見。皮膚傷口感染以金黃色葡萄球菌為多見。（3）抗生素可以治病，同時也會產(chǎn)生副作用，沒有一個抗生素是絕對安全而無副作用的。如鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素等可損害第八對腦神經(jīng)而造成耳聾。青霉素可發(fā)生過敏性休克，還會引起皮疹和藥物熱。應用廣譜抗生素如四環(huán)素等會使體內耐藥細菌大量生長繁殖，而引起新的更嚴重的感染，因此使用抗生素應有的放矢，不可濫用。（4）新生兒、老年人和肝腎功能不全的人應避免或慎用主要經(jīng)肝臟代謝和腎臟排泄的毒性較大的抗生素。（5）預防性應用抗生素要嚴加控制，盡量避免在皮膚、粘膜等局部使用抗生素，因其易導致過敏反應，也易引起耐藥菌株的產(chǎn)生。銅綠假單胞菌CMC
3、C10104中青霉素結合蛋白-3的克隆表達和純化引言：銅綠假單胞菌是一種能夠感染植物、動物和人類的革蘭氏陰性細菌，醫(yī)院中的病人因他們的肺部、血液、尿液、皮膚、和軟組織被銅綠假單胞菌感染而發(fā)病甚至死亡。銅綠假單胞菌也是一種重要的水生病原菌，廣泛分布在各種各樣的水體中，并且對消毒劑、干燥、紫外輻射等其他的物理化學因子具有很強的抗性，因此可以造成急性腸胃炎、腦膜炎、敗血癥和急性皮膚病。由于銅綠假單胞菌耐藥性的出現(xiàn)，因此迫切需要去選擇一些抗菌策略來控制它們的感染。細胞壁結構對于細菌的生存是非常的重要，青霉素結合蛋白（PBPs）是一些膜結合酶，它們主要參與到細菌細胞壁合成的后期
4、階段。它們在70年前就已經(jīng)被開發(fā)利用，被認為是B-內酰胺類抗生素的目標結合物。銅綠假單胞菌PAO1的基因組編碼的四種高分子量的青霉素結合蛋白（PBPs）,包括一級A酶(PBP1a)和三級B酶(PBP2,PBP3,andPBP3a),它們與大腸桿菌中對應的酶是直系同源的。同時，銅綠假單胞菌的青霉素結合蛋白（PBP3）與大腸桿菌的對應蛋白具有42%序列一致性。銅綠假單胞菌的青霉素結合蛋白（PBP3）是有兩個部分組成的蛋白，它包括：一個C-端的轉肽酶結合到一個延伸的N-端領域?？偟膩碚f，PBP3與其他種類的青霉素結合蛋白是相似的，雖然它缺乏PBP2X結構所特有的C-端附屬結
5、構，但是它和其他種類的PBPS一樣，都具有a-螺旋亞基或頭部結構朝向PBP3的N-端，這在PBP2結構中是沒有的。種類B的青霉素結合蛋白的N-端區(qū)域的功能目前還不清楚，但是很有可能使轉肽酶的結構遠離細胞內膜。在銅綠假單胞菌中PBP3是一個藥物作用靶點，并且已經(jīng)證明了是大部分B-內酰胺類抗生素的重要的藥物作用靶點，B-內酰胺類藥物通常是用于治療假單胞菌屬的感染。包括頭孢菌素類似物、頭孢霉素、頭孢他啶、哌拉西林、和注射用藥物的抗生素、多利培南。然而，在最近幾年，青霉素結合蛋白的改變使得銅綠假單胞菌對B-內酰胺類的抗生素具有耐藥性。使用高劑量的哌拉西林來處理臨床的分離菌，表
6、明了這與抗生素結合到PBPs上的減少有關。實驗菌株缺乏B-內酰胺酶，在銅綠假單胞菌中PBP3的過量表達導致了它們對頭孢霉素的敏感性降低。因此，進一步研究PBP3的基因和結構是很有必要很有意義。銅綠假單胞菌CMCC10104是一種典型的培養(yǎng)菌株，在中國廣泛使用。然而，它的基因組和蛋白質組學的研究沒有報道過。在本研究中，根據(jù)銅綠假單胞菌PAO1的基因組信息將編碼PBP3的基因從銅綠假單胞菌CMCC10104中克隆出來，克隆出來的基因和GenBank數(shù)據(jù)庫中報道過的其他PBP3基因序列進行對比，不同之處是實驗的條件優(yōu)化了蛋白的表達。帶有Ni2+–NTA瓊脂糖的固定化金屬親和
7、色譜層析(IMAC)法用于純化重組蛋白PBP3，純化的PBP3蛋白的活性通過青霉素結合實驗來測定。材料和方法細菌、質粒、酶、試劑和培養(yǎng)基：菌株P.aeruginosaCMCC10104是從中國的菌種保藏中心獲得，大腸桿菌DH5a用于載體的轉化，E.coliBL21(DE3)用作蛋白表達的宿主菌，質粒pMD19-T和pET44b分別用于T-A克隆和蛋白質的表達。限制性核酸內切酶、T4DNA連接酶和TaqDNA聚合酶都是購于Takara(Japan).分子生物試劑盒和IMAC等儀器試劑都是來源于BIO-RAD(USA).其他的分析試劑都是購于上海生工試劑
