資源描述：
《大腸桿菌和銅綠假單胞菌中蛋白表達監(jiān)測系統(tǒng)的構(gòu)建》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、大腸桿菌和銅綠假單胞菌中蛋白表達監(jiān)測系統(tǒng)的構(gòu)建中文摘要20世紀(jì)90年代，“人類基因組計劃”的推進和完成，標(biāo)志著“后基因組時代”的到來，“功能基因組學(xué)”中蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提上了未來生命科學(xué)研究的日程。目前蛋白質(zhì)研究的主要方法是通過2-DE配合質(zhì)譜對蛋白質(zhì)的分離鑒定。雖然對蛋白質(zhì)的研究技術(shù)在不斷地改進，但是目前的生物化學(xué)技術(shù)已不能滿足研究蛋白質(zhì)組所需要的高靈敏度、高通量以及可規(guī)模化的要求，對于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究期待著新型的技術(shù)方法的突破。本課題以大腸桿菌和銅綠假單胞菌為研究對象，采用了將帶有RBS的目的基因克隆至缺失自身RBS的報道基因luxABCDE上游，構(gòu)建二者共用RBS的預(yù)期
2、的蛋白表達監(jiān)測系統(tǒng)；報道基因的表達量取決于克隆基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯水平，利用發(fā)光值讀取儀檢測CPS值衡量目的基因蛋白質(zhì)的表達量。對該監(jiān)測系統(tǒng)進行驗證，并將兩種菌的全基因組克隆至各自相應(yīng)的監(jiān)測系統(tǒng)中，建立反映蛋白質(zhì)表達情況的熒光值數(shù)據(jù)庫。在大腸桿菌中，將重組載體pUCNot-lux中得到的報道基因luxABCDE克隆至蛋白表達載體pPROEXHTa、pPROEXHTb、pPROEXHTc，初步構(gòu)建得到大腸桿菌的蛋白表達監(jiān)測系統(tǒng)，命名為pPROEXHTa-lux、pPROEXHTb-lux、pPROEXHTc-lux。報道基因luxABCDE在載體pPROEXHTc-lux中翻譯時能
3、夠正確閱讀；并在IPTG梯度濃度條件下，測定含有載體pPROEXHTc-lux的細菌發(fā)光量，由結(jié)果可知克隆到蛋白表達載體中的缺失自身RBS的報道基因luxABCDE可以使用載體上游的trc啟動子及其RBS，并且該報道基因的蛋白表達受到trc啟動子調(diào)節(jié)因素的調(diào)節(jié)。測定預(yù)期的蛋白表達載體pPROEXHTc-lux中的報道基因luxABCDE兩側(cè)的序列，結(jié)果表明載體pPROEXHTc與報道基因luxABCDE連接處的堿基序列與已知堿基序列相同。在銅綠假單胞菌中，將從已構(gòu)建的大腸桿菌蛋白表達監(jiān)測載體酶切后得到的luxABCDE（a）、luxABCDE（b）、luxABCDE（c）克隆
4、至去除原有報道基因luxCDABE的pMS402剩余載體中，初步構(gòu)建銅綠假單胞菌蛋白表達監(jiān)測系統(tǒng)，命名為pMS402-luxABCDE（a）、pMS402-luxABCDE（b）、pMS402-luxABCDE（c）。在大腸桿菌和銅綠假單胞菌中構(gòu)建的蛋白表達監(jiān)測方法可以實現(xiàn)高通量、高靈敏度、規(guī)?；约皩Φ拓S度蛋白表達的監(jiān)測；該監(jiān)測方法不僅可用于蛋白質(zhì)組學(xué)的基礎(chǔ)理論性研究，而且可用于攻克重大疾病和開發(fā)生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的實踐應(yīng)用性研究。關(guān)鍵詞：大腸桿菌，銅綠假單胞菌，蛋白表達監(jiān)測系統(tǒng)57ConstructionofProteinExpressionMonitoringSystemi
5、nEscherichiacoliK12andPseudomonasaeruginosaPAO1AbstractGenomicshasbeenfocusedonbyresearchersduringthe20thcentury.Thenproteomicswasbeingthemainstudyingdirectioninthepost-genomiceraaftertheaccomplishmentofthe“HumanGenomeProject”.Variousmethodslike2-DEtechniquewithMassSpectrometrywereusuallyus
6、edforisolatingandidentifyingproteins.However,thosetechniquesstillcouldn’tmeettheneedsofproteomedevelopment.Therefore,exploringahighsensitiveandhigh-throughputandlarge-scaleresearchmethodisimperactiveandbeingexpected.Inthisstudy,Escherichiacoli(E.coli)andPseudomonasaeruginosaPAO1wereselected
7、ashostcellsforconstructingaproteinexpressionmonitoringsystem,respectively,usingthereportergenewithoutitsself-RBS.SincethereportergenecouldsharetheRBSoftheclonedgene,thetranscriptionalandtranslationallevelsoftheclonedgeneweredependedontheintensityoflumine
