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《銅綠假單胞菌cmcc中青霉素結(jié)合蛋白-的克隆表達(dá)和純化.》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、由于抗生素可用于治療各種感染性疾病，有的人就將抗生素作為萬(wàn)能藥，不管得了什么病，都用抗生素治療。要知道，濫用抗生素，可引起許多不良的后果。因此強(qiáng)調(diào)合理使用抗生素，重視抗生素的毒副作用是很有必要的。那么，該如何合理使用抗生素呢？（1）病毒性疾病不宜用抗生素治療。上呼吸道感染以及咽痛、咽峽炎，大部分是病毒感染所致，因此這類(lèi)疾病無(wú)需抗生素而應(yīng)使用病毒靈、病毒脞等抗病毒藥物以及中草藥治療。（2）應(yīng)根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)結(jié)果選用抗生素。但如果受條件限制或病情危急，亦可根據(jù)感染部位和經(jīng)驗(yàn)選用，然而可靠性較差。一般情況下，呼吸道感染以革蘭氏陽(yáng)性球菌為多見(jiàn)。尿道和膽道感染以革蘭氏陰性
2、菌為多見(jiàn)。皮膚傷口感染以金黃色葡萄球菌為多見(jiàn)。（3）抗生素可以治病，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生副作用，沒(méi)有一個(gè)抗生素是絕對(duì)安全而無(wú)副作用的。如鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素等可損害第八對(duì)腦神經(jīng)而造成耳聾。青霉素可發(fā)生過(guò)敏性休克，還會(huì)引起皮疹和藥物熱。應(yīng)用廣譜抗生素如四環(huán)素等會(huì)使體內(nèi)耐藥細(xì)菌大量生長(zhǎng)繁殖，而引起新的更嚴(yán)重的感染，因此使用抗生素應(yīng)有的放矢，不可濫用。（4）新生兒、老年人和肝腎功能不全的人應(yīng)避免或慎用主要經(jīng)肝臟代謝和腎臟排泄的毒性較大的抗生素。（5）預(yù)防性應(yīng)用抗生素要嚴(yán)加控制，盡量避免在皮膚、粘膜等局部使用抗生素，因其易導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)，也易引起耐藥菌株的產(chǎn)生。銅綠假單胞菌CMC
3、C10104中青霉素結(jié)合蛋白-3的克隆表達(dá)和純化引言：銅綠假單胞菌是一種能夠感染植物、動(dòng)物和人類(lèi)的革蘭氏陰性細(xì)菌，醫(yī)院中的病人因他們的肺部、血液、尿液、皮膚、和軟組織被銅綠假單胞菌感染而發(fā)病甚至死亡。銅綠假單胞菌也是一種重要的水生病原菌，廣泛分布在各種各樣的水體中，并且對(duì)消毒劑、干燥、紫外輻射等其他的物理化學(xué)因子具有很強(qiáng)的抗性，因此可以造成急性腸胃炎、腦膜炎、敗血癥和急性皮膚病。由于銅綠假單胞菌耐藥性的出現(xiàn)，因此迫切需要去選擇一些抗菌策略來(lái)控制它們的感染。細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)對(duì)于細(xì)菌的生存是非常的重要，青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）是一些膜結(jié)合酶，它們主要參與到細(xì)菌細(xì)胞壁合成的后期
4、階段。它們?cè)?0年前就已經(jīng)被開(kāi)發(fā)利用，被認(rèn)為是B-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的目標(biāo)結(jié)合物。銅綠假單胞菌PAO1的基因組編碼的四種高分子量的青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）,包括一級(jí)A酶(PBP1a)和三級(jí)B酶(PBP2,PBP3,andPBP3a),它們與大腸桿菌中對(duì)應(yīng)的酶是直系同源的。同時(shí)，銅綠假單胞菌的青霉素結(jié)合蛋白（PBP3）與大腸桿菌的對(duì)應(yīng)蛋白具有42%序列一致性。銅綠假單胞菌的青霉素結(jié)合蛋白（PBP3）是有兩個(gè)部分組成的蛋白，它包括：一個(gè)C-端的轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合到一個(gè)延伸的N-端領(lǐng)域。總的來(lái)說(shuō)，PBP3與其他種類(lèi)的青霉素結(jié)合蛋白是相似的，雖然它缺乏PBP2X結(jié)構(gòu)所特有的C-端附屬結(jié)
5、構(gòu)，但是它和其他種類(lèi)的PBPS一樣，都具有a-螺旋亞基或頭部結(jié)構(gòu)朝向PBP3的N-端，這在PBP2結(jié)構(gòu)中是沒(méi)有的。種類(lèi)B的青霉素結(jié)合蛋白的N-端區(qū)域的功能目前還不清楚，但是很有可能使轉(zhuǎn)肽酶的結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)離細(xì)胞內(nèi)膜。在銅綠假單胞菌中PBP3是一個(gè)藥物作用靶點(diǎn)，并且已經(jīng)證明了是大部分B-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的重要的藥物作用靶點(diǎn)，B-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物通常是用于治療假單胞菌屬的感染。包括頭孢菌素類(lèi)似物、頭孢霉素、頭孢他啶、哌拉西林、和注射用藥物的抗生素、多利培南。然而，在最近幾年，青霉素結(jié)合蛋白的改變使得銅綠假單胞菌對(duì)B-內(nèi)酰胺類(lèi)的抗生素具有耐藥性。使用高劑量的哌拉西林來(lái)處理臨床的分離菌，表
6、明了這與抗生素結(jié)合到PBPs上的減少有關(guān)。實(shí)驗(yàn)菌株缺乏B-內(nèi)酰胺酶，在銅綠假單胞菌中PBP3的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致了它們對(duì)頭孢霉素的敏感性降低。因此，進(jìn)一步研究PBP3的基因和結(jié)構(gòu)是很有必要很有意義。銅綠假單胞菌CMCC10104是一種典型的培養(yǎng)菌株，在中國(guó)廣泛使用。然而，它的基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究沒(méi)有報(bào)道過(guò)。在本研究中，根據(jù)銅綠假單胞菌PAO1的基因組信息將編碼PBP3的基因從銅綠假單胞菌CMCC10104中克隆出來(lái)，克隆出來(lái)的基因和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道過(guò)的其他PBP3基因序列進(jìn)行對(duì)比，不同之處是實(shí)驗(yàn)的條件優(yōu)化了蛋白的表達(dá)。帶有Ni2+–NTA瓊脂糖的固定化金屬親和
7、色譜層析(IMAC)法用于純化重組蛋白PBP3，純化的PBP3蛋白的活性通過(guò)青霉素結(jié)合實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定。材料和方法細(xì)菌、質(zhì)粒、酶、試劑和培養(yǎng)基：菌株P(guān).aeruginosaCMCC10104是從中國(guó)的菌種保藏中心獲得，大腸桿菌DH5a用于載體的轉(zhuǎn)化，E.coliBL21(DE3)用作蛋白表達(dá)的宿主菌，質(zhì)粒pMD19-T和pET44b分別用于T-A克隆和蛋白質(zhì)的表達(dá)。限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶和TaqDNA聚合酶都是購(gòu)于Takara(Japan).分子生物試劑盒和IMAC等儀器試劑都是來(lái)源于BIO-RAD(USA).其他的分析試劑都是購(gòu)于上海生工試劑
