熊果酸對a549細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機(jī)制

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1、熊果酸對A549細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機(jī)制【摘要】目的探討三萜酸類化合物熊果酸(UrsolicAcid,UA)對人肺腺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其分子機(jī)制。方法利用噻唑藍(lán)(MTT)比色法觀察UA對A549細(xì)胞增殖的影響。流式細(xì)胞儀檢測UA對細(xì)胞周期的影響。用Hoechst33258熒光染色觀察凋亡細(xì)胞核形態(tài)變化。利用免疫印跡法(I1640、PI染料、MTT、RNA酶、Hoechst33258及UA均購自Sigma公司；兔抗人Caspase3多克隆抗體、NFκB單克隆抗體購于美國SantaCruz公司；二甲基亞砜、噻唑藍(lán)為Amresco公司進(jìn)口分裝。1

2、.1.2主要儀器設(shè)備流式細(xì)胞儀為Beckman公司產(chǎn)品，倒置光學(xué)顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品，熒光顯微鏡為LEica公司產(chǎn)品，半干轉(zhuǎn)印儀為Biorad公司產(chǎn)品。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)A549細(xì)胞用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取指數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。1.2.2增殖抑制實(shí)驗(yàn)將A549細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至1.0×105/L,加200μl于96孔板中，24h后換液，設(shè)空白調(diào)零組(不接種細(xì)胞)、對照組(只含等量溶劑)及實(shí)驗(yàn)組(加不同濃度的干預(yù)藥物),每組設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)一定時間后加入MTT(5g/L)20μl，繼續(xù)

3、培養(yǎng)4h后吸出上清，每孔加DMSO150μl，振蕩溶解10min，待結(jié)晶完全溶解后，在酶聯(lián)免疫測定儀上選擇波長570nm處，空白孔調(diào)零，測定各孔吸光度A值。計(jì)算增殖抑制率=[(對照組吸光度值－處理組吸光度值)/對照組吸光度值]×100％。用直線回歸方程求得UA作用48h后的半數(shù)抑制濃度（IC50），此濃度為以下實(shí)驗(yàn)的干預(yù)濃度。1.2.3細(xì)胞周期檢測取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞2×105/ml接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至密度達(dá)60%～70%。實(shí)驗(yàn)設(shè)對照組（不加藥物），UA（IC50）均重復(fù)3瓶。培養(yǎng)24h、48h后常規(guī)收集細(xì)胞，PBS洗3次后，70%冷乙醇4℃固定過夜。檢測

4、前PBS洗兩次,10μg/ml的RNA酶37℃消化0.5h,100μg/ml的PI避光染色30min,置流式細(xì)胞儀檢測。1.2.4Hoechst33258熒光染色將A549細(xì)胞以1×105/ml濃度接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2ml，37℃，5%CO2培養(yǎng)24h后加入UA（IC50），使它的繼續(xù)培養(yǎng)48h，棄去培養(yǎng)基后，用固定液（甲醇∶冰乙酸＝3∶1）固定20min。PBS漂洗2次后，加入10μg/ml的Hoechst33258，37℃避光染色10min。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)。1.2.5in后進(jìn)行10%SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDSPAGE)電泳，用半干轉(zhuǎn)膜儀將

5、蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5％脫脂奶粉封閉。分別以Caspase3、NFκB抗體進(jìn)行免疫印跡雜交(兔抗人Caspase3多克隆抗體濃度1∶100和鼠抗人NFκB單克隆抗體濃度1∶1000)4℃下孵育過夜,洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶1000稀釋)，37℃孵育1h，ECL顯色，壓片。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS11.5軟件進(jìn)行單因素方差分析，半數(shù)抑制濃度（IC50）用直線相關(guān)與回歸法計(jì)算。2結(jié)果2.1增殖抑制實(shí)驗(yàn)20～60μmol/LUA對A549具有一定增殖抑制效果，且呈較明顯的濃度和時間依賴性，統(tǒng)計(jì)分析表明，除UA30μmol/L與40μmol/L

6、作用A549細(xì)胞24h比較，差異無顯著性（P＝0.185），UA20μmol/L與30μmol/L作用A549細(xì)胞48h比較差異無顯著性（P＝0.075）外，其余比較，見表1。經(jīng)直線回歸分析，得UA作用48h的半數(shù)抑制濃度IC50＝46.65μmol/L。表1UA對A549細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng):同一時間，與相鄰低濃度作用后的抑制率比較，P＜0.05#:同一濃度，與相鄰前一作用時間的抑制率比較，P＜0.052.2細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，與對照組相比，UA能引起A549細(xì)胞G0/G1期阻滯，見圖1。46.65μmol/LUA作用A549細(xì)胞24h后，G0/G1期細(xì)胞由（5

7、5.5±3.1）%增加到（63.5±3.4）%(P<0.05)，作用48h后上升更為明顯，為（73.0±3.5）%(P<0.05)。2.3Hoechst33258染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)改變46.65μmol/LUA作用A549細(xì)胞48h后，和處理，用熒光顯微鏡觀察，可以看到細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)凝集或核片段形成凋亡小體，見圖2a。對照組細(xì)胞熒光染色較淺且較均勻，未見凋亡細(xì)胞，見圖2b。2.4,etal.ApoptoticactivityofursolicacidmaycorrelateulatesapoptosisinHT29ce

8、llsfo