三氧化二砷對骨髓瘤細胞系u266抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的機制研究論文

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1、三氧化二砷對骨髓瘤細胞系U266抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的機制研究論文【摘要】本研究探討三氧化二砷（As2O3）在體外對骨髓瘤細胞系U266的生物學(xué)效應(yīng)及其機制。用MTT法觀察As2O3對U266細胞增殖的影響，用流式細胞術(shù)、DNA凝膠電泳法分析As2O3對U266細胞凋亡的影響，以RTPCR法檢測2μmol/LAs2O3不同處理時間對U266細胞人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白催化亞單位（hTERT）mRNA的表達變化，用yelomaCellLineU266AbstractTheaimofthisstudyechanismsunderlyingeffectofarsenictrio

2、xide(As2O3)onmyelomacelllineU266invitro.TheviabilityandapoptosisofU266cellsetryandDNAagarosegelelectrophoresis.TheexpressionofhTERTmRNAol/L.Aftertreatmentol/LAs2O3at24,48and72hours,adoseandtimedependentapoptosisofU266cellscouldbeobserved.AftertreatingU266cellsol/LAs2O3atdifferenttimep

3、oints,atimedependentreductionofprocaspase3,hTERTmRNAandproteinitochondrialtransmembranepotential,initiatingthemitochondialapoptosispathyeloma;U266cell;cellsapoptosis;caspase3;hTERT多發(fā)性骨髓瘤（multiplemyeloma,MM）是一種以骨髓中單克隆漿細胞惡性增殖并分泌大量單克隆免疫球蛋白為特征的漿細胞腫瘤，多引起廣泛骨質(zhì)破壞、反復(fù)感染、貧血、高鈣血癥、高粘滯血癥、腎功能不全等一系列

4、臨床表現(xiàn)。目前，MM仍無法治愈。近幾年來國內(nèi)外研究報道，三氧化二砷（As2O3）在復(fù)發(fā)和難治性MM的治療中取得了可喜的療效。相關(guān)基礎(chǔ)研究也發(fā)現(xiàn)，As2O3在體外通過使細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子P15、P16和P21重新表達或表達增強，下調(diào)癌基因cmyc的表達以及影響?zhàn)じ椒肿颖磉_等多種機制影響骨髓瘤細胞增殖周期，促進其凋亡并影響其歸巢。但是，As2O3對骨髓瘤細胞的作用機制尚未完全清楚［1-6］。因此，我們以骨髓瘤細胞株U266為體外模型，探討As2O3對骨髓瘤細胞的作用及相關(guān)機制。材料和方法材料和試劑As2O3為黑龍江伊達藥業(yè)公司產(chǎn)品，用注射用水稀釋至1×103

5、μmol/L的儲存液，使用時用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋至工作濃度。MitoCaptureMitochondrialApoptosisDetectionKit購自美國Biovision公司。實驗中使用的單克隆抗體及二抗均購自SantaCruzBiotechnology公司。骨髓瘤細胞株U266由上海第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院血液科侯健教授惠贈。U266細胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、5％CO2、飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞用于實驗。As2O3對U266細胞生長影響的MTT法檢測將不同濃度As2O3處理48小時及一定濃度的As2O

6、3處理不同時間后的樣本置于酶標儀上檢測波長492nm的吸光度，每組設(shè)6個平行孔，以對照組（0μmol/L）細胞增殖率為100％，按下述公式計算細胞增殖率。細胞增殖率（％）＝（藥物組OD492/對照組OD492）×100%細胞凋亡的DNA凝膠電泳檢測調(diào)整U266細胞濃度至2×105/ml，加入As2O3使終濃度為2μmol/L，作用0、24、48、72小時后，將5×105細胞移入無菌的1.5mlEppendorf管中，4℃2000r／min離心5分鐘，棄上清。加入20μl溶解緩沖液，用移液管尖混勻細胞沉淀。加10μlRNA酶A(500U/ml)，輕彈管尖混勻。37℃孵育

7、90分鐘。加10μl蛋白酶K(20mg/ml)，輕彈管尖混勻，50℃孵育過夜。樣品于20g/L瓊脂糖凝膠，25V，電泳3小時后，在凝膠成像系統(tǒng)中成像觀察。細胞凋亡的流式細胞術(shù)檢測收集細胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液接種于25ml培養(yǎng)瓶，細胞濃度為2×105/ml，加入As2O3使終濃度為2μmol/L和5μmol/L，空白對照組只含培養(yǎng)液，處理0、24、48、72小時后，收集處理后細胞，計數(shù)，然后按MitoCaptureMitochondrialApoptosisDetectionKit試劑盒說明書進行操作后,立即送流式細胞儀檢測。hT