三氧化二砷抑制u266細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡及與血管

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1、三氧化二砷抑制U266細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡及與血管【摘要】目的探討三氧化二砷(As2O3)在體外對(duì)骨髓瘤細(xì)胞系U266增殖、凋亡的影響及與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)的關(guān)系。方法四唑鹽比色法(MTT)觀察As2O3對(duì)U266細(xì)胞增殖的影響;缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)分析As2O3對(duì)U266細(xì)胞凋亡的影響;逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RTPCR)檢測(cè)2μmol/LAs2O3不同處理時(shí)間后U266細(xì)胞VEGFmRNA表達(dá)的變化;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)As2O3不同濃度不同處理時(shí)間對(duì)U266細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)的變化。結(jié)

2、果(1)As2O3明顯抑制U266細(xì)胞增殖,半數(shù)抑制濃度(IC50)為2μmol/L;(2)As2O3能誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡,呈劑量依賴性;(3)As2O3(2,5,10μmol/L)分別處理72h后細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF量呈劑量依賴性減少;(4)考慮細(xì)胞增殖對(duì)VEGF分泌的影響,2μmol/LAs2O3處理組的上清VEGF量與對(duì)照組的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,RTPCR顯示2μmol/LAs2O3處理的U266細(xì)胞個(gè)體VEGFmRNA的表達(dá)無變化。結(jié)論As2O3可以誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡,抑制其增殖。As2O3可以通過抑制細(xì)胞增殖、

3、誘導(dǎo)凋亡,減少腫瘤負(fù)荷,減少VEGF總量,但是不改變細(xì)胞個(gè)體VEGF的表達(dá)?！娟P(guān)鍵詞】砷劑多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子類多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種單克隆漿細(xì)胞惡性增殖并分泌大量單克隆免疫球蛋白為特征的漿細(xì)胞腫瘤,主要侵犯骨髓,也可侵犯髓外組織,常引起廣泛骨質(zhì)破壞、反復(fù)感染、貧血、高鈣血癥、高黏滯血癥及腎功能不全等一系列臨床表現(xiàn)。目前,MM仍無法治愈。近幾年來,國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道As2O3在復(fù)發(fā)和難治性MM的治療中取得可喜療效[1]?；A(chǔ)研究也發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）通過多種途徑、多樣化機(jī)制參與MM的病理形成及臨床

4、特征的產(chǎn)生[2]。筆者以骨髓瘤細(xì)胞株U266為體外模型,探討As2O3對(duì)骨髓瘤細(xì)胞作用后表達(dá)的變化,分析兩者關(guān)系。1材料和方法1.1材料1.1.1細(xì)胞株骨髓瘤細(xì)胞株U266由上海第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院血液科侯健教授惠贈(zèng)。1.1.2主要試劑As2O3(黑龍江伊達(dá)藥業(yè)公司)用注射用水稀釋至1×103μmol/L(儲(chǔ)存液),原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、RTPCR試劑盒(美國(guó)Promega公司),Trizol試劑(美國(guó)Invitrogene公司),人VEGF酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(美國(guó)Pierce公司),RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)

5、Gibco公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。1.2方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)U266細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPMI1640液,在37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2飽和濕度條件下的孵箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。1.2.2MTT法檢測(cè)As2O3對(duì)U266細(xì)胞增殖的影響將不同濃度As2O3處理48h及半數(shù)抑制濃度(IC50)的As2O3處理不同時(shí)間后的樣本置于酶標(biāo)儀,檢測(cè)光密度[D(492nm)],每組設(shè)6個(gè)平行孔,以對(duì)照組(0μmol/L)細(xì)胞增殖率為100％,按公式計(jì)算細(xì)胞增殖率:細(xì)胞增殖率(%)＝

6、[藥物組D(492nm)/對(duì)照組D(492nm)]×100%1.2.3TUNEL法檢測(cè)原位細(xì)胞凋亡收集0,2,5,10μmol/LAs2O3處理36h后的細(xì)胞,涂片后用新鮮配置的4g/L多聚甲醛固定,0.2%Triton○RX100室溫滲透5min,沖洗后加入TdT反應(yīng)液,37℃溫盒孵育60min,1×SSC枸櫞酸鈉緩沖液浸泡15min終止反應(yīng),加入1∶500辣根過氧化物酶100μL,室溫反應(yīng)30min,加入DAB混合液,出現(xiàn)淡棕色背景后沖洗,高倍鏡下觀察,DAB顯色后凋亡細(xì)胞呈棕褐色。1.2.4RTPCR檢測(cè)VEGF基

7、因表達(dá)收集2μmol/LAs2O3不同處理時(shí)間組細(xì)胞,提取總RNA,按照試劑盒說明書合成cDNA。VEGF基因擴(kuò)增引物及內(nèi)參βactin由上海生工生物工程有限公司合成。VEGF擴(kuò)增片斷為VEGF121408bp和VEGF165541bp。上游:5/gaagtggtgaagttcatggatgtc3/下游:5/cgatcgttctgtatcagtctttcc3/內(nèi)參βactin基因上游引物:5/cgctgcgctggtcgtcgaca3/下游引物:5/gtcacgcacgatttcccgct3/擴(kuò)增片斷為6

8、19bp。PCR條件,VEGF94℃30s→64℃60s→72℃60s,共32個(gè)循環(huán)產(chǎn)物,在20g/L瓊脂糖凝膠上電泳,凝膠成像系統(tǒng)顯示及分析結(jié)果。1.2.5VEGF含量檢測(cè)采用ELISA技術(shù),按試劑盒說明書操作,樣品及VEGF標(biāo)準(zhǔn)品均采用復(fù)孔,在酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度[D(450