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《三氧化二砷誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡和bcl》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、三氧化二砷誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡和Bcl：鄭亦胡，周蒙滔，單云峰，張啟瑜【摘要】 目的：探討三氧化二砷(As2O3)是否能夠誘導(dǎo)SGC7901胃癌細(xì)胞凋亡，以及Bcl-2的表型變化是否在其中發(fā)揮了作用。方法：將不同濃度的三氧化二砷作用于SGC7901細(xì)胞，采用CCK-8進(jìn)行細(xì)胞毒檢測(cè)；采用DAPI染色進(jìn)行細(xì)胞核形態(tài)分析；采用免疫熒光顯微鏡觀察不同表型的Bcl-2表達(dá)的變化；采用ethods:SGC7901humangastriccancercellseasuredbyusingtheCellCountingAssayKit-8.Analysisofnuclearmorphologymunof
2、luorescencemicroscopy.TheexpressionofBcl-2inedangastriccancercells，andtheapoptosisaybeexpressedthroughtheinductionofBcl-2phenotpechangeratherthandoachneoplams；apoptosis；Bcl-2 近年來(lái)，大量研究證實(shí)三氧化二砷在體外對(duì)于多種惡性腫瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用，包括胃癌、肺癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌、鼻咽癌、膽囊癌、宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌[1-2]，但是對(duì)于三氧化二砷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制卻仍然存在爭(zhēng)議。下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表
3、達(dá)是一種重要的作用機(jī)制[2-4]。最新的研究卻發(fā)現(xiàn)，Bcl-2具有細(xì)胞保護(hù)和破壞兩種表型，其不同的表型被其蛋白構(gòu)象所調(diào)控[5]，這種構(gòu)象的改變可以使Bcl-2從一個(gè)細(xì)胞保護(hù)作用變成破壞作用。本實(shí)驗(yàn)擬研究三氧化二砷是否能夠誘導(dǎo)SGC7901胃癌細(xì)胞凋亡并觀察Bcl-2的表達(dá)量和表型的變化，探討其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制?！ ?材料和方法 1.1主要試劑 三氧化二砷購(gòu)自哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)公司，濃度：10mg/10mL。RPMI1640培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司?？笲cl-2N端兔多抗IgG、抗Bcl-2鼠單抗IgG、抗β-actin鼠單抗IgG1購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司?？?/p>
4、Bcl-2BH3結(jié)構(gòu)域抗體購(gòu)自美國(guó)Abgent公司。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗鼠二抗、Cy3標(biāo)記的抗兔IgG、DAPI染料購(gòu)自碧云天生物研究所。CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑購(gòu)自美國(guó)ThermoScientific公司。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。 1.2細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞株SGC7901購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所，予含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，在5%CO2飽和濕度的37℃孵箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)滿后經(jīng)胰酶消化法傳代。 1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 首先使用細(xì)胞毒檢測(cè)求
5、得三氧化二砷作用SGC7901胃癌細(xì)胞24h的50%細(xì)胞死亡的濃度（IC50），再用IC50的濃度作用SGC7901胃癌細(xì)胞，爾后進(jìn)行細(xì)胞核形態(tài)分析、Bcl-2表型和Bcl-2表達(dá)的檢測(cè)。 1.4細(xì)胞毒檢測(cè) 細(xì)胞以1.5×104個(gè)/cm2的密度接種于100μL的96孔板中預(yù)培養(yǎng)24h。使用含0.1%BSA的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步化。爾后被不同濃度的三氧化二砷分別處理24h，利用日本同仁化學(xué)研究所生產(chǎn)的CCK-8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞毒檢測(cè)，根據(jù)廠家的操作手冊(cè)進(jìn)行操作。按公式計(jì)算：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組光密度值/對(duì)照組光密度值）×100%?！ ?.5凋亡細(xì)胞核
6、形態(tài)分析 細(xì)胞以1.5×104個(gè)/cm2的密度，接種于6孔板上，使用10μmol/L的三氧化二砷處理24h。細(xì)胞經(jīng)4%的多聚甲醛固定后，用PBS清洗。在暗室中經(jīng)1μg/mL的DAPI染色15min后，使用免疫熒光顯微鏡進(jìn)行觀察（波長(zhǎng)為340~380nm、放大倍數(shù)為1000）?！ ?.6Bcl-2的表型觀察和檢測(cè) 細(xì)胞以1.5×104個(gè)/cm2的密度，接種于6孔板上，使用10μmol/L的三氧化二砷處理24h。經(jīng)4%的多聚甲醛固定后，用PBS清洗。使用1%的TritonX-100做透膜處理后，再使用5%的小牛血清蛋白進(jìn)行封閉，添加一抗（1:50）在4℃過(guò)夜孵育，然后加入Cy3標(biāo)記的二抗
7、（1:100）在室溫下孵育2h，最后加入1μg/mL的DAPI復(fù)染細(xì)胞核。使用免疫熒光顯微鏡進(jìn)行觀察（放大倍數(shù)為1000）。一抗包括：抗Bcl-2N端抗體、抗Bcl-2BH3結(jié)構(gòu)域抗體?！ ?.72的密度接種于75cm2大小的培養(yǎng)瓶中，經(jīng)10μmol/L的三氧化二砷處理24h。胰酶消化后收集細(xì)胞。蛋白抽提方法和WesternBlot蛋白印跡法參照美國(guó)Pierce公司說(shuō)明書(shū)。使用BCA法測(cè)定蛋白濃度，β-actin作為參照。 1.8
