低分子肝素對(duì)大鼠腦局灶性缺血再灌注后bcl2，bax表達(dá)的影響及保護(hù)作用論文

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1、低分子肝素對(duì)大鼠腦局灶性缺血再灌注后Bcl2，Bax表達(dá)的影響及保護(hù)作用論文高素玲，王大力，常莉莎，趙曉晶，張麗【摘要】目的：觀察低分子肝素對(duì)大鼠腦缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)Bcl2,Bax表達(dá)的影響及保護(hù)作用.方法：①選用雄性SD大鼠54只，體質(zhì)量280～330g.應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為3組：假手術(shù)組、缺血再灌注組和低分子肝素組，每組18只.②應(yīng)用免疫組化方法測(cè)定海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡基因Bcl2,Bax表達(dá)情況.③采用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)對(duì)兩組間數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.結(jié)果：大鼠54只均進(jìn)入結(jié)果分析，缺血再灌注組大鼠腦缺

2、血再灌注6.freelo齡，體質(zhì)量280～330g［華北煤炭醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)scxk（冀）20050001］.動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境自然光照，環(huán)境安靜，溫度適中.應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為3組：假手術(shù)組、缺血再灌注組、低分子肝素組，每組18只.低分子肝素(速避凝，杭州賽諾菲圣得拉堡民生制藥有限公司)；Bcl2,Bax試劑盒、PV6001(兔二步法)、DAB顯色劑、PBS試劑盒、APES粘片劑、EDTA修復(fù)液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；蘇木素、伊紅、多聚甲醛和無(wú)水乙醇（本院病理教研室）；CMIAS真彩醫(yī)學(xué)圖像

3、分析系統(tǒng)(北京航空航天大學(xué)研制)；Olympus攝像顯微鏡(日本)；KPJ1烤片機(jī)(天津)；Leica石蠟切片機(jī)(德國(guó))；LY3型切片機(jī)(上海)；微量液體加樣器(上海)；數(shù)碼溫控微波爐(天津)；手術(shù)操作臺(tái)(自制)；60℃～100℃水育箱(上海).1.2方法1.2.1模型制作采用改良Longa等［2］法制作大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞局灶性腦缺血再灌注模型.造模成功評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：①提尾時(shí)大鼠左前肢內(nèi)收屈曲；②爬行時(shí)向左側(cè)傾倒或按逆時(shí)針方向轉(zhuǎn)圈;③右眼Horner征.1.2.2分組干預(yù)假手術(shù)組只游離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈.

4、缺血再灌注組和低分子肝素組均建立大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞局灶性腦缺血再灌注模型.缺血2h后分別腹腔注射生理鹽水1mL和皮下注射低分子肝素（200U/kg，用生理鹽水稀釋至1mL），兩組均于缺血2.5h后開始再灌注6，12，24h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取6只進(jìn)行觀察.1.2.3標(biāo)本采集與檢測(cè)將大鼠在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)經(jīng)腹腔注射100mL/L水合氯醛（0.003～0.004mL/g）再次麻醉，固定四肢及頭部，迅速打開胸腔暴露心臟，剝離心包，將灌注針頭自左心室插入到升主動(dòng)脈，固定針頭，剪開右心耳，依次灌注生理鹽水100mL，40g/L多聚甲醛(0.

5、01mol/LPBS，pH7.4)500mL，待肝臟變白變硬后，將大鼠斷頭取腦，去除嗅球、腦干、小腦，以視交叉和其后4mm處兩點(diǎn)冠狀切片，取腦組織塊，置4℃，40g/L多聚甲醛24h，常規(guī)脫水，包埋制成蠟塊.石蠟切片厚度5μm，40℃水浴展開，用經(jīng)粘片劑處理過(guò)的載玻片撈片，置于60℃烤箱中烘烤1h，再行HE染色和免疫組織化學(xué)染色.石蠟切片脫蠟至蒸餾水，EDTA微波熱修復(fù)，維持煮沸10min，冷卻至室溫，3mL/LH2O2甲醇封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10min，用PBS洗3次，每次洗3min，正常山羊血清封閉內(nèi)源性抗原20min

6、，滴加適當(dāng)稀釋（1∶100）的一抗，40℃過(guò)夜，PBS洗3次，每次洗3min，滴加抗兔HRP多聚體，在37℃放置40min，DAB顯色鏡檢控制.應(yīng)用醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)及攝像顯微鏡記錄Bcl2，Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，陽(yáng)性部位位于細(xì)胞質(zhì)，計(jì)數(shù)4個(gè)不重復(fù)高倍視野(×200)中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，數(shù)值用x±s表示.1.2.4主要觀察指標(biāo)觀察各組不同時(shí)間點(diǎn)Bcl2,Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù).統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果以x±s表示，采用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)對(duì)兩組間數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.2結(jié)果2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析納入大鼠54只，均

7、進(jìn)入結(jié)果分析，無(wú)脫失值.2.2低分子肝素對(duì)大鼠腦缺血再灌注Bcl2,Bax表達(dá)的影響假手術(shù)組Bcl2,Bax中均有微弱表達(dá).低分子肝素組的缺血側(cè)海馬CA1區(qū)Bcl2在神經(jīng)元內(nèi)的表達(dá)隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)，再灌注后6,12,24h,低分子肝素組的Bcl2表達(dá)量明顯增多（圖1），與缺血再灌注組比較具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為-5.190,-15.005,-14.116,.freelain等［7］通過(guò)對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠應(yīng)用LMCAO2.5h再灌注6，12，24h缺血側(cè)海馬區(qū)Bax的表達(dá)顯著增加，Bcl2表

8、達(dá)不明顯，給予低分子肝素處理后，Bax表達(dá)減少，Bcl2表達(dá)增加，說(shuō)明應(yīng)用低分子肝素治療后能抑制Bax的表達(dá)，增加Bcl2表達(dá)，改善缺血再灌注損傷，提示低分子肝素可能是通過(guò)減少Bax蛋白的表達(dá)、上調(diào)的Bcl2表達(dá)，從而減輕神經(jīng)元的損傷及凋亡，起到腦保護(hù)的作用.【