白花丹參和紫花丹參生化標(biāo)記分析

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1、白花丹參和紫花丹參生化標(biāo)記分析【摘要】　　目的分析白花丹參和紫花丹參在蛋白水平的遺傳差異。方法利用葉片過氧化物酶和種子貯藏蛋白兩種生化標(biāo)記對白花丹參和紫花丹參進(jìn)行了分析。結(jié)果同工酶分析表明，兩種丹參間過氧化物酶同工酶譜存在差異；貯藏蛋白分析表明，丹參種子蛋白主要是以鹽溶性蛋白為主，水溶蛋白和醇溶蛋白較少，堿溶性蛋白更少；兩種丹參種子貯藏蛋白譜帶之間的差異性不明顯。結(jié)論二者在蛋白水平存在一定差異?！娟P(guān)鍵詞】紫花丹參；白花丹參；貯藏蛋白；同工酶；聚丙烯酰胺凝膠電泳法；生化標(biāo)記　　Abstract：ObjectiveToanalyzeicalmarkers(per

2、odiaseandstorageprotein).MethodsTicalmakersofperodiaseandstorageproteinidegelelectrophoresis,mostofstorageproteinse;PAGE;Biochemicalmarker　　丹參Salviamiltiorrhiza味苦、性微寒，功能活血祛淤，安神寧心，排膿止痛〔1〕，臨床應(yīng)用范圍較廣。就其形態(tài)學(xué)性狀而言，可分白花、紫花兩種。傳統(tǒng)育種中的形態(tài)學(xué)鑒定只能揭示外觀差異且受環(huán)境影響較大，不能完全揭示品種間的遺傳差異。生化標(biāo)記是以基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)作為遺傳標(biāo)記，主

3、要包括貯藏蛋白、同工酶和等位酶標(biāo)記〔2〕。生化標(biāo)記分析是一種快速、簡便、有效的遺傳檢測手段。作為生化標(biāo)記的同工酶、非酶形式的蛋白質(zhì)，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于遺傳種質(zhì)的分離、篩選、品種鑒定以及生物多樣性、雜種優(yōu)勢的研究中〔3～6〕?！　”狙芯坷觅A藏蛋白和過氧化物酶同工酶兩種生化標(biāo)記對白花丹參和紫花丹參進(jìn)行了分析，以期了解其在蛋白質(zhì)性狀水平的遺傳差異,為種質(zhì)資源的收集和二者藥效成分上的比較提供理論依據(jù)。　　　1材料與方法　　1.1材料供試材料白花丹參和紫花丹參均由山東中醫(yī)藥大學(xué)藥圃提供?！　?.2方法　　1.2.1過氧化物酶提取稱取1g鮮材料，冰浴研磨，加入1ml稀

4、釋4倍的濃縮膠緩沖液（pH=6.7），冰浴超聲提取15min，8000r/min，0℃離心20min。上清液加入等體積40%蔗糖溶液混勻，作為供試溶液，可在4℃冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆谩！　?.2.2蛋白質(zhì)提取蛋白質(zhì)提取分為分步提取和一次性提取兩種。分步提取主要研究丹參種子中各類蛋白質(zhì)的組成及比例；一次性提取主要比較在不同提取液的情況下，蛋白質(zhì)譜帶的帶型?！　》植教崛》椒ǎ喝〉⒎N子粉碎后稱取0.1g，加入600μl水，在60℃水浴中提取40min，10000r/min離心5min，取上清液備用，再用水按同樣方法沖提1次，離心棄掉上清液。然后加入600μl2.5%Na

5、Cl溶液，用同樣方法提取上清液備用，再用2.5%NaCl沖提1次，離心棄掉上清液，用水沖洗1次。再加入400μl的50%異丙醇提取液，在同樣條件下，提取上清液備用。最后加入400μl0.2%NaOH，同樣條件，提取上清液備用。最后提取的各種蛋白質(zhì)溶液，和樣品處理液（20%甘油，0.1%溴酚藍(lán)，20%濃縮膠緩沖液）等體積混合后用于電泳分析。　　一次性提取方法：丹參種子粉碎后分別稱取0.05g，分別加入600μl水，600μl2.5%鹽溶液，600μl50%異丙醇和600μlNaOH，在60℃水浴中提取40min，離心取上清液。按分步提取法加入樣品處理液后電泳〔

6、7〕?！　?.2.3電泳方法聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）對過氧化物酶和貯藏蛋白進(jìn)行電泳分析。DYY-III30穩(wěn)壓、穩(wěn)流型電泳儀（北京六一儀器廠），YY0155-94型電泳槽，采用垂直板凝膠電泳，凝膠板22cm×10cm。凝膠為30%丙烯酰胺、1%甲叉雙丙烯酰胺，分離膠10%，濃縮膠3%，以TEMED和過硫酸銨為催化系統(tǒng)，以Tris-甘氨酸為電極緩沖液，150V穩(wěn)壓條件下電泳4h?！　?.2.4染色膠板剝離后，用于跑過氧化物酶的膠放在聯(lián)大茴香胺染色液中，間歇性搖動，染色2h，拍照。蛋白電泳的膠放在考馬斯亮藍(lán)染色液(0.08%考馬斯亮藍(lán)，10%三氯乙酸)中染

7、色2h?！　?.2.5脫色種子貯藏蛋白電泳的膠放至25%甲醇，10%乙酸溶液中脫色直到看到電泳條帶，拍照?！　?結(jié)果　　2.1丹參葉片過氧化物酶同工酶分析白花丹參在5.1，7.9，8.7cm處各有1條帶，共3條；而紫花丹參在6.3，7.5，8.2，8.7cm處各有1條帶，共4條（見圖1）。說明不同表型的丹參品種間在同工酶分析上存在著差異，理論上可以以此作為品種劃分的依據(jù)之一?！　?.2丹參種子蛋白質(zhì)種類的分析用分步提取法對白花丹參和紫花丹參兩品種種子提取得到的水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、醇溶性蛋白和堿溶性蛋白電泳結(jié)果見圖2。由分析結(jié)果看出，在丹參種子中以鹽溶性蛋

8、白為主，水溶性蛋白和醇溶性蛋白較少，堿溶性蛋白含量極