凹葉厚樸莖段愈傷組織誘導(dǎo)中的褐變控制研究

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1、凹葉厚樸莖段愈傷組織誘導(dǎo)中的褐變控制研究【摘要】目的研究愈傷組織誘導(dǎo)過程中的褐變問題。方法：將采集的標(biāo)本進(jìn)行外植體滅菌法再接種到培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加抗褐變劑，進(jìn)行防褐變試驗(yàn)。結(jié)果外植體在4℃冰箱冷藏48h的預(yù)處理對褐變有較好的控制效果。在培養(yǎng)基中加入抗褐變劑比加入吸附劑抗褐變效果好，抗褐變劑中Vc的效果最佳，吸附劑PVP比活性炭好。結(jié)論培養(yǎng)條件，以低溫遮光處理效果較好，光、溫兩個(gè)因素中，凹葉厚樸對光敏感，遮光能有效抑制褐變。液體淺層靜置培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)抗褐變的效果比單純的固體培養(yǎng)效果好。【關(guān)鍵詞】凹葉厚樸；莖段；愈傷組織；褐變控

2、制；冷藏外植體；抗褐變劑；吸附劑；液體淺層靜置培養(yǎng)〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕ＯｂｊｅｃｔｉｖｅTostudythebrofragmentsasexplantsduringinducingthecallus.MethodTheexplantediuminediumedium;VitaminCaterialinallanti-broperatureiseffectiveforthetissuecultureconditions,Maganoliabiloba（Rehdetoreeffectiveintheshallofragment;callus

3、;broaterials;adsorbent;shallog/L+6-BA1mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8~6.0。每次處理10瓶，每瓶5個(gè)外植體，外植體大小約為0.6cm×0.6cm。1.2方法1.2.1外植體滅菌預(yù)處理后的材料用75%乙醇消毒30s，再用0.1%升汞溶液浸泡10min，無菌水沖洗4次，吸干，在PVP1g/L溶液中切割，接種到培養(yǎng)基上。1.2.2防褐化試驗(yàn)分4個(gè)方面分別進(jìn)行，即：外植體預(yù)處理、培養(yǎng)基中加入防褐變劑或吸附劑、培養(yǎng)條件、固體培養(yǎng)和液體淺層靜置培養(yǎng)后再固體培養(yǎng)。外植體預(yù)處理：用洗衣粉清洗，自來水沖洗1h

4、，瀝干后，保鮮膜密封置于4℃的冷藏箱分別冷藏24、48h，設(shè)對照為不冷藏。培養(yǎng)基中加抗褐變劑和吸附劑試驗(yàn)：培養(yǎng)基中加入Vc（10mg/L）、LH（1g/L）、巰基乙醇（1mL/L）、PVP（1g/L）、活性炭（2g/L）。培養(yǎng)條件試驗(yàn)：①低溫遮光處理（20℃，遮光20d后，轉(zhuǎn)入25℃及光下，光強(qiáng)1500LX）；②遮光處理（25℃，遮光20d，轉(zhuǎn)入25℃及光下，光強(qiáng)1500LX）；③對照(25℃，每天光照10h，光強(qiáng)1500LX）。培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)，在配好的培養(yǎng)基中加入6.5g/L的瓊脂；液體淺層靜置培養(yǎng)，不加瓊脂，瓶內(nèi)培養(yǎng)基深度約為0.

5、4cm，培養(yǎng)10d后，轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基中。計(jì)算方法：誘導(dǎo)率=（形成愈傷組織的外植體塊數(shù)/接種的外植體塊數(shù)）×100%。褐變率=（褐變的外植體塊數(shù)/接種的外植體塊數(shù)）×100%。2結(jié)果2.1外植體預(yù)處理對褐變的影響由表1可看出預(yù)冷處理有降低褐變的效果，使褐變率從對照的45%降低為30%~35%。冷藏時(shí)間48h比24h好。2.2培養(yǎng)基中加抗褐變劑和吸附劑對褐變的影響表2結(jié)果看出，抗褐變劑和吸附劑能很明顯的防止外植體的褐變，而且抗褐變劑的效果比吸附劑好，前者褐變率為10.5%~18%，后者達(dá)到20.5%~25.5%。2.3培養(yǎng)條件對褐變的影響表

6、3實(shí)驗(yàn)中，低溫遮光處理與遮光處理的抑制褐變率相差不大，而兩者與對照比較，都有較大的差異。由表3的結(jié)果看來，在20~25℃之間，凹葉厚樸莖段愈傷組織的誘導(dǎo)對溫度要求不嚴(yán)格，而對光敏感。2.4固體培養(yǎng)基和液體淺層靜置培養(yǎng)由表4的結(jié)果來看，液體淺層靜置培養(yǎng)一段時(shí)間后再轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基中比單純固體培養(yǎng)基中的效果要好。3結(jié)論本文從4個(gè)方面考察了不同處理對凹葉厚樸莖段誘導(dǎo)愈傷組織中褐變的影響：（1）外植體在4℃冰箱冷藏48h的預(yù)處理對褐變有較好的控制效果，這可能與低溫狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)多酚氧化酶活性降低以及酚類化合物合成減少有關(guān)。（2）在培養(yǎng)基中加入抗褐

7、變劑和吸附劑，抗褐變劑的效果比吸附劑好，抗褐變劑中Vc的效果最佳，其作用機(jī)制主要是通過將多酚氧化酶（PPO）作用下形成的醌類物質(zhì)重新還原為酚而減輕褐變[2]61-62，這與前人的試驗(yàn)結(jié)果一致[3]。PVP是酚類物質(zhì)的專一性吸附劑，在生化制備中常用作酚類物質(zhì)和細(xì)胞器的保護(hù)劑[4]16-17，防止褐變的效果比無機(jī)吸附劑活性炭好。（3）培養(yǎng)條件以低溫遮光處理效果較好，光溫兩個(gè)因素中，凹葉厚樸對光敏感，遮光能有效抑制褐變，這可能是在黑暗條件下，阻斷了酚類物質(zhì)的生化合成途徑，降低了酚類化合物的含量，同時(shí)抑制了PPO活性，減輕了酚類物質(zhì)的氧化有關(guān)[

8、4]18，光照會提高PPO的活性，促進(jìn)酚類物質(zhì)的氧化。溫度對褐變造成的影響有兩個(gè)方面的原因：較低的溫度有利于傷口的愈合；另外，會降低PPO的生物活性，從而減輕褐變[2]63。（4）液體淺層靜置培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)