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1、外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞改善肢體缺血的研究 王輝，王嶺，李開(kāi)宗，凌瑞，孫寶華，李曉軍，易軍【關(guān)鍵詞】?jī)?nèi)皮；干細(xì)胞；移植；外周血【Abstract】AIM:Toestimatetheeffectofhumanperipheralbloodderivedendothelialprogenitorcell(EPC)transplantationontherepairmentoflimbischemia.METHODS:Themononuclearcellsfromhumanperipheralbloodediumsupplemented,20ng/mLVEGFand4ng/mLbFGFinv
2、itro.ThespecificmarkersofEPCoralartery,greatsaphenousartery,iliaccircumflexartery,andmuscularbranchof15Balb/cnudemicebischemia.The6dayadherencecellsmarkedbyCMDiIultipointinjectedintotheleftlocalmusclesofischemiclimbs(EPCgroup)andM199ultipointinjectedintotherightlocalmusclesofischemiclimbs(M199
3、group)inordertoevaluatethetherapeuticeffect.Sevendaysafteroperation,60μgFITCUEAicebgastroemiusinedicroscopy.ThenumberofcapillariesofischemiclimbseasuredbyfactorⅧrelatedantigenimmunohistochemicalstaining.RESULTS:Theculturedcellsatday6expressedKDR,CD133,CD34andv199group(P0.05).Redandgreenfluores
4、cenceiclimbsofnudemiceintheEPCgroup.CONCLUSION:199培養(yǎng)液重懸，以2×108/L的密度接種于一次性培養(yǎng)瓶中.每3d換液，用Hanks液洗掉未貼壁的細(xì)胞后加入M199培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng).在培養(yǎng)的第6日和第14日分別對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，并制作流式細(xì)胞儀檢測(cè)標(biāo)本，共12份，分別做KDR,CD133,CD34和vDiI濃度為2mg/L，在37℃孵育5min，4℃15min,PBS洗2次后，2.5g/L胰酶/EDTA消化，離心后重懸于M199培養(yǎng)液中.后肢缺血裸鼠共15只，左后肢局部多點(diǎn)注射擴(kuò)增后的貼壁細(xì)胞，共5mL，細(xì)胞總量5×105，為EPC治療組；右
5、后肢局部多點(diǎn)注射M199培養(yǎng)液，共5mL，為M199對(duì)照組.移植標(biāo)記細(xì)胞后的第8日,脫臼處死裸鼠.處死前1h，從尾靜脈注入20mg/LFITC標(biāo)記的的荊豆凝集素3mL.取心、肝、肺、脾、腎及雙后肢小腿肌肉40g/L甲醛固定后作石蠟切片，脫蠟后熒光顯微鏡下觀察.1.2.4裸鼠后肢情況的檢測(cè)手術(shù)后每日觀察裸鼠后肢色澤、溫度的變化和活動(dòng)情況.雙后肢小腿肌肉石蠟切片做vWF免疫組化染色，在光學(xué)顯微鏡下,每張切片隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)×200倍視野內(nèi)的棕黃色染色管狀數(shù)取其平均數(shù)，表示新生的毛細(xì)血管數(shù).統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:計(jì)量資料以x±s表示，組間統(tǒng)計(jì)處理采用配對(duì)t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用Fisher確切概率檢驗(yàn)分析
6、(n=30).所有統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS11.0軟件完成.2結(jié)果2.1人外周血單個(gè)核細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定人外周血單個(gè)核細(xì)胞在培養(yǎng)48h后出現(xiàn)貼壁,從第4日開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)的改變，由圓形細(xì)胞逐漸向兩端伸展呈紡錘形，數(shù)量增多(圖1)，在培養(yǎng)第5日出現(xiàn)大量的梭形細(xì)胞,可見(jiàn)部分梭形細(xì)胞以細(xì)胞團(tuán)為中心呈放射狀生長(zhǎng).培養(yǎng)第7~10日,細(xì)胞繼續(xù)增多，可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞特異性索條狀結(jié)構(gòu).到第14日鋪滿瓶底的80%，第6日和第14日細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為(3.75±0.36)×108/L和(1.52±0.28)×108/L.培養(yǎng)第6日的貼壁細(xì)胞表達(dá)KDR,CD133,CD34和vDiI)和黃綠色(代表FITCUEA
7、)雙色熒光的細(xì)胞摻入(圖2)，說(shuō)明移植的EPC定向整合到了缺血局部.其他臟器以及M199對(duì)照組后肢，則未見(jiàn)雙色熒光.圖2EPC組后肢肌肉中可見(jiàn)紅色和黃綠色雙色熒光2.3肢體缺血情況的檢測(cè)EPC組缺血后肢肌肉中的毛細(xì)血管密度高于M199組〔（6.8±1.5）vs（3.8±1.6),P0.05〕,說(shuō)明EPC組的血管重建過(guò)程增強(qiáng)，EPC的移植極大地改善了缺血肢體的恢復(fù).M199對(duì)照組中僅有2條后肢未出現(xiàn)明顯壞死，3條后肢趾端壞死，10只出現(xiàn)小腿的自動(dòng)脫落；而在EPC組,有1
