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《胚胎大鼠大腦額葉皮質(zhì)神經(jīng)干細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。
1、胚胎大鼠大腦額葉皮質(zhì)神經(jīng)干細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定作者：徐漢榮,晉光榮,張海軍,趙連東,顧寶榮［摘要］目的:探討從胚胎大鼠大腦額葉皮質(zhì)分離培養(yǎng)神經(jīng)干細胞(neuralstemcell,NSCs)的方法及NSCS的特性。方法:將145d胎齡的大鼠額葉皮質(zhì)腦組織制備成單細胞懸液，于含EGF和bFGF的DMEM/F12無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng),形成原代細胞球后，進行單細胞克隆傳代擴增。免疫熒光組化方法檢測克隆球Nestin、Map2、GFAP抗體標記情況。結(jié)果:原代培養(yǎng)2周后，可形成大量懸浮生長的神經(jīng)球，BrdU和Nestin檢測呈陽性，誘導分
2、化后呈Map2、GFAP陽性。結(jié)論:可從胚鼠腦皮質(zhì)中分離培養(yǎng)純化、擴增傳代獲得NSCs，經(jīng)誘導后可以分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞，可作為細胞替代治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的供體來源?！ 。坳P(guān)鍵詞］神經(jīng)干細胞;純化;誘導分化；大鼠 神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷、缺血及退行性疾病的治療一直是困擾醫(yī)學界的一個難題。人和哺乳動物體內(nèi)及胚胎體內(nèi)神經(jīng)干細胞(neuralstemcells,NSCs)的發(fā)現(xiàn),為解決這一難題點燃了新的希望。目前，眾多學者從各種途徑探索治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的生物材料及治療方法［12］。NSCs是一類具有自我更新和多向分化潛能的特殊細胞。利用
3、它不僅可以探討神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的分子機制,也可作為細胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、退行性疾病及腦腫瘤等疾病。胚胎期的NSCs主要位于紋狀體、大腦皮質(zhì)、視網(wǎng)膜以及脊髓等部位［1,3］，目前利用細胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成功地從上述部位分離出多潛能NSCs。盡管NSCs是未分化細胞,不同來源的NSCs之間仍有差別。與中腦及脊髓起源的NSCs相比,紋狀體及皮質(zhì)NSCs更適合于細胞移植替代那些因腦內(nèi)疾病受損的神經(jīng)元［4］。本研究以胚胎大鼠為供體,采用單細胞克隆技術(shù)選擇性分離探索了大腦額葉皮質(zhì)NSCs的純化、標記、不同誘導分化方法及鑒定技術(shù),為進一步研究N
4、SCs的生物學特性和NSCs移植替代治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供生物材料及方法?！ ?材料與方法 11材料145d胎齡的SD大鼠由東南大學動物實驗中心提供。DMEM/F12培養(yǎng)基為Invitrogen公司產(chǎn)品，B27輔助培養(yǎng)基、堿性成纖維細胞生長因子(basicfibroblastgroalgrop;D公司,其他免疫組化試劑購自北京中山公司?！ ?.2方法 121取材與培養(yǎng)無菌條件下脫頸處死大鼠，在體視顯微鏡下小心解剖大腦額葉皮質(zhì)，機械剪碎,015%胰蛋白酶消化10min,含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液終止消化5min。滴管反復吹打成單
5、細胞懸液,1000r・min-1離心10min。細胞重懸于NSCs培養(yǎng)液,即DMEM/F12(1∶1),B27(體積分數(shù)為0.02),EGF(20ng・ml-1)，F(xiàn)GF(20ng・ml-1)。調(diào)整細胞濃度為（4－5）×105ml-1。接種到塑料培養(yǎng)瓶,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng),每3~4d更換培養(yǎng)液1次。待原代克隆形成后再次用機械分離法制作單細胞懸液,按5×105細胞密度接種于50ml培養(yǎng)瓶中,每隔7～10d機械分離克隆傳代1次，用1ml注射器(帶5號針頭)用力吹打混勻(同時
6、換培養(yǎng)液)。采用有限稀釋法單細胞克隆連續(xù)傳代。將細胞接種于96孔板,選取只有1個細胞的孔連續(xù)觀察,將其增殖所形成的單細胞克隆機械分離成單細胞懸液,將所有細胞接種于25ml培養(yǎng)瓶中,待次代克隆長成后連續(xù)傳代?！ ?22NSCs增殖與分化的標記鑒定克隆球Nestin鑒定:將經(jīng)過多次連續(xù)傳代所形成的克隆細胞球接種于預先置有多聚賴氨酸涂層蓋玻片的6孔板中,培養(yǎng)液成分為DMEM/F12（1∶1)、B27輔助培養(yǎng)基(1×50)、20ng・ml-1bFGF和20ng・ml-1EGF,培養(yǎng)7d后行免疫熒光細胞化學染色,
7、觀察NSCs特異性抗原Nestin的表達情況。克隆球誘導分化細胞的鑒定：將經(jīng)過多次連續(xù)傳代所形成的克隆細胞球吹打成單細胞，調(diào)整細胞濃度為（4~5）×105ml-1接種到含5mmol・L-1無血清DMEM/F12(含20ng・ml-1bFGF,20ng・ml-1EGF及B27輔助培養(yǎng)液)塑料培養(yǎng)瓶培養(yǎng)形成新的神經(jīng)球。將神經(jīng)球接種于多聚賴氨酸包被的蓋玻片的6孔板,加入20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液貼壁生長。7d后4%多聚甲醛固定分化細胞5min,封閉液(1%山羊血清蛋白,03%Triton10
8、0)封閉30min。加一抗4℃過夜,PBS漂洗3次,每次10min,然后加入FITC熒光素或羅丹明的相應(yīng)二抗,孵育30min,棄二抗,PBS漂洗3次,每次10min,磷酸甘油封片,熒光顯微鏡下觀察。對照組采用001mol・L-1PBS
