一種新的重組腺病毒載體padbm5gfpmafp的構(gòu)建

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1、一種新的重組腺病毒載體pAdBM5GFPmAFP的構(gòu)建作者：匡志鵬，謝裕安，梁安民，羅小玲，吳繼寧【摘要】目的構(gòu)建表達(dá)小鼠甲胎蛋白（murinealphafetoprotEin，mAFP）基因的重組腺病毒載體pAdBM5GFPmAFP，并測定其滴度。方法從Hepa16小鼠肝癌細(xì)胞中提取總RNA，設(shè)計特異性引物，通過RTPCR法擴(kuò)增mAFP基因，測序確認(rèn)后,插入到pAdBM5GFP穿梭載體中，雙酶切鑒定重組腺病毒載體。線性化重組腺病毒載體與病毒骨架DNA質(zhì)粒用磷酸鈣共沉淀法共轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞，通過同源重組使腺病毒表達(dá)mAFP基因，并在HEK293A細(xì)胞中大量擴(kuò)增

2、含目的基因的重組腺病毒，用TCID50法測定重組腺病毒滴度。結(jié)果成功克隆了小鼠mAFP基因，構(gòu)建出表達(dá)mAFP基因的重組腺病毒載體pAdBM5GFPmAFP，獲得了表達(dá)mAFP基因的重組腺病毒，病毒滴度達(dá)3.2×108PFU／ml。結(jié)論本研究成功構(gòu)建了pAdBM5GFPmAFP載體，獲得了高滴度表達(dá)mAFP基因的重組腺病毒，為進(jìn)一步開展肝癌的免疫基因治療奠定了基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】pAdBM5GFP；小鼠甲胎蛋白；重組腺病毒載體　　Abstract：ObjectiveToconstructanovelrebinantadenovirusvectorpAdBM5GFPmAF

3、Panddetectvirustiter.MethodsTotalRNAhepa16murinelivercancercellline,mAFP(murinealphafetoprotEIn，mAFP)geneethod.ThegeneeIrestrictenzymedigestiontoconstructpAdBM5GFPmAFPrebinantvector.mAFPgeneologousrebinantinHEK293AcellsafterpAdBM5GFPmAFPvectorandvirusskeletonplasmidcotransfectedHEK293Ace

4、llsbystandardcalciumphosphatecoprecipitationmethod.Virustiterethod.ResultspAdBM5GFPmAFPrebinantvectorAFPgenel.ConclusionpAdBM5GFPmAFPrebinantadenoviralvectorcarryingmAFPgenearylivercancer.　　KeyAFP；Rebinantadenovirusvector　　0引言　　大多數(shù)肝癌細(xì)胞過表達(dá)AFP抗原。Meng等［1,2］認(rèn)為人甲胎蛋白是最重要的一種肝癌治療性靶抗原。Vollmer等［3,4

5、］也發(fā)現(xiàn)盡管小鼠的免疫系統(tǒng)長期暴露于AFP環(huán)境中，當(dāng)被合適地或特異性地激發(fā)時，仍能對這種胚胎性抗原產(chǎn)生較強(qiáng)的T細(xì)胞免疫反應(yīng)。由此說明，AFP能夠作為一種潛在的誘導(dǎo)特異性CTL反應(yīng)的腫瘤抗原用于AFP分泌性肝癌的靶向性免疫治療。因此，本研究將肝癌相對較為特異的甲胎蛋白（AFP）基因構(gòu)建到含有強(qiáng)力啟動子的pAdBM5腺病毒載體中，從而擴(kuò)增出大量高效表達(dá)目的基因的重組腺病毒，為開展肝癌的靶向性免疫基因治療完成關(guān)鍵的一步?！　?材料與方法　　1.1腺病毒和細(xì)胞株Hepal6細(xì)胞為C57BL/6小鼠來源的肝癌細(xì)胞株，可分泌小鼠甲胎蛋白（mAFP），由第二軍醫(yī)大學(xué)王皓博士惠贈。HEK293

6、A細(xì)胞、pAdBM5GFP穿梭載體和腺病毒轉(zhuǎn)染試劑盒購自Qbiogene公司。TOP10感受態(tài)細(xì)胞購自北京天為時代科技有限公司?！　?.2主要試劑　　DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(GIBCO)，Trizol(Invitrogen)，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、pGMTEasy載體和TLigase（Promega），PyrobestTMDNA聚合酶（TaKaRa），BglII和PmeI內(nèi)切酶（BioLabs）。低熔點瓊脂糖SeaplaqueR購自畢特博生物技術(shù)公司。質(zhì)粒提取試劑盒，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自上海華舜生物科技公司?！　?.3方法　　1.3.1Hepal6細(xì)胞

7、的培養(yǎng)及總RNA的抽提采用DMEM培養(yǎng)液及10%FBS常規(guī)培養(yǎng)Hepal6細(xì)胞，每3天換液傳代。取約106個細(xì)胞抽提總RNA，操作按Trizol試劑說明進(jìn)行?！　?.3.2RTPCR擴(kuò)增mAFP基因上游引物：5′AAGATCTCTGCGGTGAAGGAACAAG3′；下游引物：5′GGTTTAAACGCCCAAAGCATC3′，并在兩側(cè)分別引入BglII和PmeI兩個酶切位點,引物由賽百盛公司合成。擴(kuò)增片段約1850bp。擴(kuò)增條件：94℃4min，94℃30sec，5