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《小鼠白介素17基因表達(dá)、純化、活性鑒定及抗小鼠白介素17抗體制備》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文小鼠白介素17基因的的表達(dá)、純化、活性鑒定及抗小鼠白介素17抗體的制備研究生姓名王金萍指導(dǎo)老師鄧松華沈際佳教授教授安徽醫(yī)科大學(xué)合肥230032中文摘要目的通過(guò)基因工程技術(shù)獲得有活性的重組小鼠白介素17(recombinantmouseInterleukin-17,rmIL-17)蛋白，檢測(cè)驗(yàn)證rmIL-17的活性及免疫原性。同時(shí)用純化的重組蛋白rmIL-17免疫小鼠及家兔，制備并鑒定抗rmIL-17蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體，為進(jìn)一步研究IL-17的生物學(xué)作用及其作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。方法用RT-PCR技術(shù)得到小鼠IL-17編碼基因，將其克隆入原核
2、表達(dá)載體pET32a,轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌(E.coli)BL21株，經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),通過(guò)親和層析制備純化的rmIL-17蛋白，免疫家兔制備抗rmIL-17多克隆抗體并純化多抗，用多抗做Western-blot和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)鑒定該蛋白免疫原性；用rmIL-17蛋白進(jìn)行體外小鼠成纖維細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)，將小鼠3T3成纖維細(xì)胞調(diào)整密度為4×105/ml于24孔板中，分別加入rmIL-17蛋白至終濃度0.01,0.1,1,10,100,1000ng/ml，放入CO2孵箱中共孵育24小時(shí)，取上清，用鼠IL-6定量酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒ELISA檢測(cè)IL-6濃度
3、。同樣條件下以1000ng/ml日本血吸蟲29KD膜外重組蛋白為陰性對(duì)照，培養(yǎng)基為空白對(duì)照；用rmIL-17蛋白進(jìn)行體內(nèi)中性粒細(xì)胞招募實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)組用無(wú)菌的PBS稀釋0.5μgrmIL-17蛋白至500μl，BALB/C小鼠腹腔內(nèi)注射。腹腔注射等量日本血吸蟲29KD膜外重組蛋白做對(duì)照組。0.5μgrmIL-17和10μg抗鼠IL-17中和抗體用無(wú)菌PBS稀釋至500μl，37℃孵育15分鐘2安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文后，腹腔注射，作為中和組。4小時(shí)之后分別放血處死小鼠，打開腹腔用2.5ml含有3mMEDTA的PBS沖洗，收集洗出液，進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)和中性粒細(xì)胞染色計(jì)數(shù)；用rmIL-
4、17蛋白免疫小鼠6周后，將其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行雜交融合，HAT篩選出雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)亞克隆及擴(kuò)大培養(yǎng)，建立抗rmIL-17單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。用間接ELISA法檢測(cè)雜交瘤上清。Western-Blotting實(shí)驗(yàn)鑒定單克隆抗體的免疫學(xué)特性。結(jié)果成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET32a-mIL17并在大腸桿菌中表達(dá)。過(guò)柱得到純化的rmIL-17蛋白，制備了抗rmIL-17多克隆抗體Western-blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有良好的免疫原性；體外細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)顯示該蛋白可刺激小鼠3T3成纖維細(xì)胞產(chǎn)生白介素6(Interleukin-6,IL-6)且具有量效關(guān)系;隨著加入的rmIL
5、-17蛋白濃度的升高，小鼠3T3成纖維細(xì)胞分泌IL-6的量也隨之升高；體內(nèi)細(xì)胞招募實(shí)驗(yàn)顯示純化的rmIL-17蛋白具有招募中性粒細(xì)胞的作用。以日本血吸蟲29KD膜外重組蛋白為對(duì)照組，以抗鼠IL-17中和抗體中和組，對(duì)照組(0.481±0.154)×106與實(shí)驗(yàn)組(4.27±1.10)×106差異具有顯著性(P<0.05)，中和組(2.01±0.90)×106與實(shí)驗(yàn)組(4.27±1.10)×106差異也有顯著性(P<0.05)，證實(shí)了rmIL-17的體外活性；制備兩株抗rmIL-17單克隆抗體，單抗亞型分別為IgG1,IgG2a；Western-Blotting結(jié)果證實(shí)了該2株單
6、克隆抗體的免疫學(xué)特性。結(jié)論小鼠IL-17基因在體外成功表達(dá)，且表達(dá)的重組蛋白具有明顯的生物學(xué)活性。rmIL-17多克隆抗體和單克隆抗體的制備為我們下一步的實(shí)驗(yàn)奠定了的基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞rmIL-17；原核表達(dá)；生物學(xué)活性；單克隆抗體。3安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文Expression,Purification,andIdentificationofMouseInterleukin-17andPreparationofAnti-mouseIL-17AntibodyPostgraduateGraduateadviserWangjinpingProDengsonghuaProShenjij
7、iaAbstractObjective:ThroughgeneticengineeringtechniquesobtaintheactiverecombinantmouseIL-17(recombinantmouseInterleukin-17,rmIL-17)proteintodetecttheactivityofrmIL-17certificationandimmunogenicity.AtthesametimewiththepurifiedrecombinantproteinrmIL-
