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1、酵母RNA的提取1、實驗目的1、掌握稀堿法提取RNA的原理和方法2、學習和了解其它提取RNA的方法和原理2、實驗重點和難點離心機的使用提取RNA的實驗原理3、實驗原理一般的生物細胞中同時含有DNA和RNA，在酵母中RNA比DNA的含量高得多，RNA（2.67～10.0%），DNA則少于2％(O.03％～O.516％)，在實驗室常用酵母作為RNA提取的材料。若要制備具有生物活性的RNA，可采用苯酚法、去污劑法和鹽酸胍法等，最常用的是苯酚法提取RNA；若對生物活性沒有要求，則可使用濃鹽法，稀堿法等。工業(yè)中用稀堿法或濃鹽法，主要用于制備核苷酸的原料.苯酚法：組
2、織勻漿用苯酚處理并離心后，RNA即溶于上層被酚飽和的水相中，DNA和蛋白質則留在酚層中，向水層加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出，此法能較好地除去DNA和蛋白質。濃鹽法：在加熱的條件下，利用高濃度的鹽改變細胞膜的透性，使RNA釋放出來，再利用等電點（pH為2.0～2.5）沉淀。此法易掌握，產(chǎn)品顏色較好。鹽濃度需要控制，太低，RNA不易從細胞中釋放出來，太高，細胞急劇收縮不利于抽提。一般80～120g/L為宜。稀堿法：利用細胞壁在稀堿條件下溶解，使RNA釋放出來，這種方法提取時間短，但RNA在稀堿條件下不穩(wěn)定，容易被堿分解；本實驗采用的稀堿，既可加速細
3、胞的破裂，又可增大RNA的溶解度。當堿被中和后，可用乙醇(或者異丙醇）將RNA沉淀，或用等電點沉淀RNA(應嚴格控制pH,緩慢調),此為RNA的粗品。核糖核酸含有核糖、嘌呤堿、嘧啶堿和磷酸各組分。加硫酸煮沸可使其水解，從水解液中可以測出上述組分的存在。核酸核苷酸磷酸核苷戊糖堿基水解（1）嘌呤堿與硝酸銀作用產(chǎn)生白色的嘌呤銀化合物沉淀。（2）磷酸與鉬酸銨試劑作用產(chǎn)生黃色的磷鉬酸銨沉淀[(NH4)3PO4·12MoO3↓],有還原劑存在時，形成藍色鉬藍。(NH4)MoO4+H2SO4H2MoO4+(NH4)2SO4H3PO4+12H2MoO4H3P(Mo3O1
4、0)4+12H2OH3P(Mo3O10)4Mo2O3?MoO3（鉬藍）還原產(chǎn)物鉬藍在波長660nm測定吸光值，當無機磷含量在1—25μg范圍內(nèi)，光吸收和含磷量成正比。RNA的含磷量為9.5%，即1μgRNA磷相當于10.5μgRNA。DNA的含磷量平均為9.9%。Vit?C（3）地衣酚(苔黑酚）顯色法：RNA與酸共熱時降解，形成戊糖，繼而形成糠醛（α-呋喃甲醛），糠醛與地衣酚（3，5-二羥基甲苯）反應，形成鮮綠色復合物，可用比色法測定。當核糖核酸濃度在10～100μg/ml范圍內(nèi)，其濃度與吸光度成線性關系需要FeCl3或Cu2+作催化劑。4、實驗操作(一
5、)RNA的提?。?）稱5g干酵母粉于150ml三角燒瓶中，加25mlO.2％的NaOH，沸水浴中攪拌提取20min。冷卻后滴加乙酸使其略偏酸性，pH約5-6，目的是去除蛋白質。（2）離心(4000r／min，13min)，去除沉淀。上清液冰浴。（3）向上清液中加入20ml（約上清液的兩倍體積）95％乙醇，稍攪拌后靜置（冰浴約10min）。待完全沉淀后離心(4000r／min，15min)，去上清液。（4）沉淀用95％乙醇洗兩次（如沉淀浮起需再次離心），每次約10mL;用乙醚洗兩次，每次10mL。目的是去除脂溶性物質和水，乙醚的沸點比乙醇的低，所以最后加乙
6、醚有利于沉淀的干燥。(二)RNA的鑒定取沉淀約1g，加10ml10％H2SO4→沸水浴中加熱30min。（5）．嘌呤堿取水解液2mL加入2mL濃氨水，然后加入約1mL5%硝酸銀溶液，觀察有無嘌呤堿的銀化合物沉淀。（慢慢加入嘌呤堿時，沉淀上浮，搖勻，沉淀下沉）（6）．核糖取1支試管加入水解液0.5mL、1mL苔黑酚三氯化鐵濃鹽酸溶液。放沸水浴中2分鐘。注意溶液是否變成綠色，說明核糖的存在。時間久了會有黑色沉淀，是濃度高，產(chǎn)物結晶出來了。5、注意事項避開磷酸二酯酶和磷酸單酯酶作用的溫度范圍20～70℃，防止RNA降解。在90～100℃條件下加熱可使蛋白質變性
7、，破壞磷酸二酯酶和磷酸單酯酶，有利于RNA的提取。在調pH值時，一定要緩慢小心，且要在低溫下進行。在洗滌時，要用乙醇洗滌，且不可用水洗，否則將導致RNA部分溶解而造成損失，降低RNA提取率。提取RNA時必須用沸水浴，并經(jīng)常攪拌，NaOH必須實現(xiàn)預熱。用乙酸調pH5～6必須有，目的可以除去一些雜質。最后過濾前必須將乙醇瀝干，不能帶水，否則RNA會粘在濾紙上，無法取下。也可以采用離心的方法。所得RNA粗品應是淺黃色粉末狀。6、原始數(shù)據(jù)記錄實驗過程中的現(xiàn)象7、討論7.1、用稀堿法提取酵母RNA的過程中需注意什么？7.2、鑒定RNA的原理？
