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《重組包涵體蛋白質(zhì)復(fù)性》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、重組包涵體蛋白質(zhì)復(fù)性鄒平基因工程技術(shù)的發(fā)展掀開了人類生命科學(xué)研究的嶄新篇章，開辟了現(xiàn)代生物工業(yè)發(fā)展的新紀(jì)元。重組DNA技術(shù)為大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)提供了可能，E.coli以其易于操作、遺傳背景清楚、發(fā)酵成本低和蛋白表達(dá)水平高等優(yōu)點(diǎn)，是生產(chǎn)重組蛋白的首選表達(dá)系統(tǒng)。但外源基因在E.coli中的高表達(dá)常常導(dǎo)致包涵體的形成，如何高效地復(fù)性包涵體蛋白是基因工程技術(shù)面臨的一個(gè)難題。隨著人類基因組計(jì)劃的完成和蛋白組計(jì)劃的實(shí)施，人們將會更多地面臨這一問題的挑戰(zhàn)。一、包涵體蛋白1、包涵體的形成包涵體主要是因?yàn)樵谥亟M蛋
2、白的表達(dá)過程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子，而無法形成正確的次級鍵等原因形成的；也可能是外源基因合成速度太快，沒有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊、二硫鍵不能正確的配對、過多的蛋白間的非特異性結(jié)合、蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度等；重組蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)也與包涵體形成有關(guān)，一般說含硫氨基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵體的形成呈正相關(guān)；重組蛋白所處的環(huán)境不適，發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點(diǎn)時(shí)易形成包涵體。2、減少包涵體形成的策略降低重組菌的生長溫度，是減少包涵體形成的最常用的方法。低生長溫度降低了
3、無活性聚集體形成的速率和疏水相互作用；細(xì)菌生長緩慢溶氧水平低，也可減少包涵體的形成。在培養(yǎng)重組菌中供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳培養(yǎng)條件，如供氧充足、合適pH等，以減少包涵體的形成。添加可促進(jìn)重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的生長添加劑，增加細(xì)胞的滲透壓。 在低的誘導(dǎo)劑條件下培養(yǎng)重組菌，減少重組蛋白表達(dá)量，也可減少包涵體的形成?！±昧蜓踹€蛋白融合表達(dá)或與目標(biāo)蛋白共表達(dá)，得到可溶性目的蛋白。篩選合適的宿主菌，使表達(dá)的重組蛋白可溶。3、包涵體破菌、分離、洗滌常用高壓勻化或機(jī)械、化學(xué)和酶相結(jié)合的方法破碎含包涵體的宿主
4、菌細(xì)胞,再將破碎液通過低速離心或過濾除去可溶蛋白后獲得包涵體。包涵體中除了目的蛋白外還含有脂類、脂多糖、核酸和雜蛋白等成分，而這些成分會影響包涵體蛋白的復(fù)性，故去折疊前應(yīng)洗滌包涵體，以去除雜質(zhì)。4、包涵體的溶解去折疊一般用強(qiáng)的變性劑如尿素、鹽酸胍，通過離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽伸展。鹽酸胍優(yōu)于尿素，因?yàn)辂}酸胍是較尿素強(qiáng)的變性劑，5尤其在堿性條件下，它能使尿素不能溶解的包涵體溶解，而且尿素分解的異氰酸鹽能導(dǎo)致多肽鏈的自由氨基甲?；?。高濃度的變性劑會嚴(yán)重破壞蛋
5、白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生不可逆變性，導(dǎo)致無法復(fù)性。包涵體溶解時(shí)要采用盡可能低的變性劑濃度。極端pH和變溫被用來溶解包涵體，以替代高濃度的變性劑。但高pH值會降解蛋白質(zhì)的N端。用去垢劑SDS、TritonX-100、Sarkosyl等，破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，溶解包涵體蛋白質(zhì)。對于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，分離的包涵體中通常含有一些鏈間和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵，需加入還原劑，如巰基乙醇、DTT、二硫赤蘚糖醇等破壞二硫鍵。當(dāng)?shù)鞍妆磉_(dá)量很高時(shí)，包涵體的在位溶解是一種非常有效的方法。但在位溶解會引起許多雜質(zhì)成分的釋放，導(dǎo)
6、致蛋白質(zhì)復(fù)性的收率下降。二、包涵體蛋白質(zhì)的復(fù)性折疊機(jī)制（幾種假說）蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)完全包含了形成高級結(jié)構(gòu)的全部信息，其組成中的氨基酸本身的特性是蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)形成的決定因素和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。多肽鏈的折疊是一個(gè)自發(fā)的過程，主要取決于給定氨基酸的序列，然而伸展肽鏈折疊為天然活性結(jié)構(gòu)的過程還受到周圍環(huán)境的影響。多年來，在蛋白質(zhì)折疊的研究中存在許多假說，最初的假設(shè)都認(rèn)為折疊步驟為：二級結(jié)構(gòu)小片段形成折疊核，此核再形成功能區(qū)域，形成“熔球態(tài)”，此后，分子立體結(jié)構(gòu)再做一些局部調(diào)整，最終形成正確的立體結(jié)構(gòu)。傳統(tǒng)的化學(xué)
7、動力學(xué)的模型集中研究此中間態(tài)轉(zhuǎn)換機(jī)制。近年來關(guān)于蛋白的折疊過程和機(jī)制的研究很多，多維能量觀（Multidimensionalenergylandscape）學(xué)說或折疊漏斗（Foldingfunnel）比較有代表性。多維能量觀和折疊漏斗的模型可以預(yù)測蛋白復(fù)性的多動力路徑，實(shí)驗(yàn)證明蛋白復(fù)性是遠(yuǎn)多于“熔球態(tài)”一個(gè)折疊路徑的。而統(tǒng)計(jì)學(xué)的研究則側(cè)重于蛋白向復(fù)性狀態(tài)轉(zhuǎn)換的整體能量觀。Dill,K.A的觀點(diǎn)，認(rèn)為蛋白復(fù)性更像多個(gè)球沿軌道滾落，而不是一個(gè)球在平面上漫無目的的滾動?？捎媚芰亢瓦m合度的景觀來解釋，此能
8、量景觀把單個(gè)的微觀行為和宏觀的現(xiàn)象聯(lián)系起來，涉及折疊動力學(xué)的波動平衡，并發(fā)展了新型快速的計(jì)算方法。折疊動力學(xué)應(yīng)用微觀理論和模型來研究，這個(gè)模型展示了蛋白折疊可用漏斗型的能量景觀來描述(如圖1)。漏斗的深度代表穩(wěn)定構(gòu)像的側(cè)鏈相互作用的自由能，而寬度代表側(cè)鏈的熵。在低的位置，能量景觀表示能量更低，更接近天然結(jié)構(gòu)，此時(shí)構(gòu)像就越少。漏斗模型可以模擬大量的變性分子從不同構(gòu)像如何快速折疊為一個(gè)天然結(jié)構(gòu)，但無法說明能量的屏障作用。5圖1：此模型說明蛋白復(fù)性的能量景觀像漏斗型。還有研究人員從拓?fù)鋵W(xué)
