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《包涵體蛋白質(zhì)復(fù)性-純化》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、包涵體蛋白復(fù)性和純化策略MarketProportionbyHostCells(biopharmaceuticalproteinsor”P(pán)harmateins”)Yeast:28%E.coli:54%Animalcell:21%E.coliinclusionbodyrouteoccupiesaboutahalf包涵體：在某些生長(zhǎng)條件下，基因工程菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無(wú)膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱(chēng)為包涵體（InclusionBodies，IB）。包涵體的組成及特性一般含有50%以上的重組
2、蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、外膜蛋白等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1um，難溶與水，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。包涵體與蛋白種類(lèi)及表達(dá)系統(tǒng)無(wú)關(guān)，僅為蛋白過(guò)量表達(dá)的結(jié)果。包涵體的形成在重組蛋白的表達(dá)過(guò)程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子，或環(huán)境不適，無(wú)法形成正確的次級(jí)鍵等原因形成的。最大缺點(diǎn)：一級(jí)結(jié)構(gòu)正確，高級(jí)結(jié)構(gòu)錯(cuò)誤。包涵體形成的主要原因1.表達(dá)量過(guò)高。原因可能是合成速度太快，以至于沒(méi)有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能完全正確的配對(duì)，過(guò)多的蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無(wú)法達(dá)到足夠的溶解度等。2.重組
3、蛋白的氨基酸組成：一般說(shuō)含硫氨基酸越多越易形成包涵體3.重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高（37-42℃）或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點(diǎn)時(shí)容易形成包涵體。4.重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類(lèi)，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。采用共表達(dá)分子伴侶的方法以增加可溶蛋白的比例。包涵體表達(dá)的有利因素Advantages:1.可溶性蛋白在細(xì)胞內(nèi)容易受到蛋白酶的攻擊，包涵體表達(dá)可以避免蛋白酶對(duì)外源蛋白的降解。2.降低了胞內(nèi)外源蛋白的濃度，有利于表達(dá)量的提高。有時(shí)甚至可以達(dá)到細(xì)胞總蛋白含量的30%3.包涵體中雜蛋白含量
4、較低，且只需要簡(jiǎn)單的低速離心就可以與可溶性蛋白分離，有利于分離純化。4.包涵體表達(dá)的蛋白質(zhì)沒(méi)有活性，細(xì)胞破碎和以后復(fù)性前的純化步驟，不用考慮蛋白質(zhì)的失活問(wèn)題。1.對(duì)表達(dá)蛋白的胞內(nèi)修飾過(guò)程不了解。2.要求復(fù)雜和精確的復(fù)性過(guò)程3.復(fù)性過(guò)程的收率往往很低，經(jīng)常成為放大的瓶頸包涵體表達(dá)的不利因素Disadvantages:分離純化細(xì)菌包涵體蛋白質(zhì)的基本步驟：破碎細(xì)胞(Disruptionofcell)↓分離包涵體(Seperationofinclusionbody)↓溶解包涵體(Dissolveinclusionbody)↓蛋白質(zhì)產(chǎn)物的構(gòu)象復(fù)原
5、等。(Recoveryoftargetproteinconformation)包涵體的復(fù)性前準(zhǔn)備洗滌：由于脂體及部分破碎的細(xì)胞膜及膜蛋白與包涵體粘連在一起，在溶解包涵體之前要先洗滌包涵體，通常用低濃度的變性劑如2M尿素在50mMTrispH7.0-8.5左右、1mMEDTA中洗滌。此外可以用溫和去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。包涵體的溶解1.采用高濃度的變性劑，使其形成伸展的肽鏈。常用的變性劑有尿素（8M）、鹽酸胍（GdnHCl6-8M），通過(guò)離子間的相互作用，破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。尿素的增溶效果稍差，異
6、氰硫酸胍（GdnSCN）最強(qiáng)。變性劑的使用濃度和作用時(shí)間：一般在偏堿性的環(huán)境中如pH8.0-9.0，尿素在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定。有些蛋白只能用鹽酸胍。增溶時(shí)一般室溫過(guò)夜，但鹽酸胍在37度1小時(shí)便可以使多數(shù)蛋白完全變性溶解。2.去垢劑：如強(qiáng)的陰離子去垢劑SDS，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，避免蛋白形成疏水核心，可以增溶幾乎所有的蛋白。但由于SDS無(wú)法徹底的去除而不允許在制藥過(guò)程中使用（研究）。3.極端pH：可以破壞蛋白的次級(jí)鍵從而增溶蛋白。如在pH>9.0溶解牛生長(zhǎng)激素和牛凝乳蛋白酶包涵體。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。這些方法只適合于少部
7、分蛋白的增溶。4.還原劑：由于蛋白間二硫鍵的存在，在增溶時(shí)一般使用還原劑。還原劑的使用濃度一般是50-100mMDTT，也有使用5mM濃度。實(shí)際，還原劑的使用濃度與蛋白二硫鍵的數(shù)目無(wú)關(guān)，而有些沒(méi)有二硫鍵的蛋白加不加還原劑無(wú)影響。對(duì)于目標(biāo)蛋白沒(méi)有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時(shí)還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，需要加入還原劑巰基乙醇、二硫蘇糖醇等。加入金屬螯合劑EDTA去除金屬離子。(伸展態(tài))U→(中間態(tài))I→(自然態(tài))N↓ A（包涵體）從中間體轉(zhuǎn)變?yōu)樘烊粦B(tài)的過(guò)程比較緩慢。當(dāng)溶液中離子強(qiáng)
8、度或變性劑濃度很低，又無(wú)其它輔助手段存在時(shí)，聚集趨勢(shì)占主導(dǎo)地位，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的自發(fā)復(fù)性效率極低。蛋白質(zhì)折疊的三態(tài)模型復(fù)性目的復(fù)性：通過(guò)緩慢去除變性劑（避免折疊中間體重新聚集）使目標(biāo)蛋白從變性的完全伸展?fàn)顟B(tài)（？
