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1、包涵體蛋白的純化和復(fù)性1．菌體的收集和破碎用50ml離心管分別收集誘導(dǎo)表達(dá)后的培養(yǎng)物，8000rpm4℃離心10min。沉淀用適量的超聲破菌緩沖液重懸。【備注】超聲破菌緩沖液（20mmol/LTris-HClpH8.0、0.5mol/LNaCl、1mmol/LEDTA、1mg/mL溶菌酶）重懸后的菌液于冰浴中進(jìn)行超聲波破碎，其條件為：功率為300W，占空比50%，每個(gè)循環(huán)30s，總時(shí)間20min。破碎后的勻漿，4℃、12000rpm離心15min。分別取上清液和沉淀進(jìn)行12%SDS-PAGE分析，確定目
2、的蛋白是否以包涵體的形式表達(dá)。2．包涵體的處理洗滌：沉淀用適量的包涵體洗滌緩沖液重懸后，攪拌洗滌20~30min，于4℃，12000rpm離心15min，棄去上清液。重復(fù)一次。再用適量的50mmol/LTrispH8.0溶液洗滌一遍（以去除殘留的EDTA），于4℃12000rpm離心15min，棄去上清液?！緜渥ⅰ堪w洗滌緩沖液（20mmol/LTris－HClpH8.0，0.5mol/LNaCl，2mol/L尿素，2％Triton）2％TritonX-100溶液：量取2mlTritonX-100(聚
3、乙二醇辛基苯基醚)液，加M緩沖液98ml即可。溶解：沉淀用適量的包涵體溶解緩沖液重懸，室溫?cái)嚢?-6小時(shí)或過(guò)夜。12000rpm4℃離心15min，收集上清液?！緜渥ⅰ堪w溶解緩沖液（20mmol/LTris－HClpH8.0，0.5mol/LNaCl，8mol/L尿素，0.2mmol/LDTT或100mmol/Lβ-巰基乙醇，2％Triton）?3．目的蛋白的純化???親和層析基于目的蛋白與固相化的配基特異結(jié)合而滯留，其他雜蛋白會(huì)流過(guò)柱子。???谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）是最常用的親和層析純化標(biāo)簽
4、之一，帶有此標(biāo)簽的重組蛋白可用交聯(lián)谷胱甘肽的層析介質(zhì)純化，但本方法有以下缺點(diǎn)：首先，蛋白上的GST必須能合適的折疊，形成與谷胱甘肽結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)才能用此方法純化；其次，GST標(biāo)簽多達(dá)220個(gè)氨基酸，如此大的標(biāo)簽可能會(huì)影響表達(dá)蛋白的可溶性，使形成包涵體，這會(huì)破壞蛋白的天然結(jié)構(gòu)，難于進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，有時(shí)即便純化后再酶切去除GST標(biāo)簽也不一定能解決問(wèn)題。???另一種可應(yīng)用的親和純化標(biāo)簽是6組氨酸標(biāo)簽,組氨酸的咪唑側(cè)鏈可親和結(jié)合鎳、鋅和鈷等金屬離子，在中性或弱堿性條件下帶組氨酸標(biāo)簽的目的蛋白與鎳柱結(jié)合，在低pH下
5、用咪唑競(jìng)爭(zhēng)洗脫。組氨酸標(biāo)簽與GST相比有許多優(yōu)點(diǎn)：首先，由于只有6個(gè)組氨酸，分子量很小，一般不需要用酶切去除；其次，可以在變性條件下純化蛋白，在高濃度的尿素和胍中仍能夠保持結(jié)合力；另外6組氨酸標(biāo)簽無(wú)免疫原性，重組蛋白可直接用來(lái)注射動(dòng)物，也不影響免疫學(xué)分析。雖然有這么多的優(yōu)點(diǎn)，但此標(biāo)簽仍有不足，如目的蛋白易形成包涵體、難以溶解、穩(wěn)定性差及錯(cuò)誤折疊等。鎳柱純化時(shí)金屬鎳離子容易脫落漏出混入蛋白溶液，不但會(huì)通過(guò)氧化破壞目的蛋白的氨基酸側(cè)鏈，而且柱子也會(huì)非特異吸附蛋白質(zhì)，影響純化效果。若目的蛋白可與某種碳水化合物
6、特異結(jié)合，或者需要某種特殊的輔因子，可將該碳水化合物或輔因子固相化制成親和柱，結(jié)合后目的蛋白可用高濃度的碳水化合物或輔因子洗脫。?融合蛋白的表達(dá)和純化過(guò)程：1.挑單菌落于3-5ml2YT或LB培養(yǎng)中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。2.按1：100的比例取過(guò)夜培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接。37℃擴(kuò)大培養(yǎng)至OD0.5左右。3.加入IPTG終濃度0.2～0.4mM/L。37℃搖床培養(yǎng)4～6h。4.12000g離心15min，去上清。按40ml/100ml菌液加入1×BindingBuffer{破碎緩沖液組成：50mMTrispH7.0～8.
7、5左右,1mMEDTA，溶菌酶(10礸/gcell)，；或20mmol/lTris-HCl,pH7.5,1mmol/lEDTA,0.1mMPMSF,DNAse(10礸/gcell)}細(xì)胞破碎緩沖液中不含脲等變性劑，故不溶解包涵體?；?×PBS重懸細(xì)胞。5.超聲波破碎：占空比50％，超聲15s，停15s，10～20min。破碎后的勻漿在4℃，12,000rpm下離心30min，棄去上清液。6.洗滌包涵體：2M尿素在50mMTrispH7.0～8.5左右,1mMEDTA，10%TritonX-100中洗滌。
8、洗滌2～4h去除膜碎片和膜蛋白。8M尿素在50mMTrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA，10%TritonX-100，二硫鍵還原劑中洗滌。洗滌4～8h，使包涵體變性可溶。7.過(guò)Ni柱：Ni2＋親和層析柱純化???包涵體溶解后的上清液，用鎳親和層析柱純化。操作過(guò)程參照AmershamPharmaciaBiotech公司提供的操作指南進(jìn)行。具體過(guò)程如下：轉(zhuǎn)移樹(shù)脂到柱子，待完全沉淀后，用三蒸水洗滌鎳親和層析柱，以除盡基質(zhì)中的乙醇和空氣，
