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《包涵體的純化和復(fù)性總結(jié)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、板塊一、大腸桿菌（這里討論的大腸桿菌為非分泌到培養(yǎng)基中的重組蛋白，是否有重組蛋白分泌到培養(yǎng)基中的工程菌我沒有見過。）一、關(guān)于菌體的量大腸桿菌表達(dá)的基因工程蛋白是純化人員最方便獲得的原料，對(duì)純化工藝開發(fā)來說幾乎沒有原料方面的限制。?？吹接袘?zhàn)友用個(gè)幾毫升的菌液去做純化，對(duì)此我十分不解，同樣要做，為什么不多做點(diǎn)呢？很少的菌體會(huì)給純化帶來一些難以估計(jì)的問題，工藝的重復(fù)性和放大往往出現(xiàn)問題。因此，要做個(gè)好工藝就多發(fā)酵表達(dá)一些菌體吧。我做純化時(shí)，初始工藝摸索用的菌體量一般為10g左右。二、關(guān)于是否包涵體表達(dá)包涵體的
2、定義我就不講了。我要講的是，一個(gè)基因工程蛋白是否是包涵體表達(dá)的說法本身就不完全準(zhǔn)確。至于包涵體在電鏡下的晶體顆粒表現(xiàn)等等對(duì)我們純化來說毫無意義，我相信做純化工藝的人沒有誰去看這個(gè)電鏡，也不關(guān)心。我們判斷的依據(jù)只是SDS-PAGE，目的蛋白在破菌沉淀中，我們就認(rèn)為是包涵體表達(dá)，但這是一個(gè)似是而非的結(jié)論?？粗鴽]問題，實(shí)際上是有毛病的。關(guān)鍵在于你用的是什么破菌緩沖液！有些蛋白在用緩沖液A破菌時(shí)是在破菌沉淀中，而用緩沖液B破菌時(shí)卻在破菌上清中。緩沖液A和B的差別可能只是pH上相差1-2個(gè)單位。那么它是包涵體表達(dá)
3、還是可溶上清表達(dá)呢？說這個(gè)問題主要在于有些戰(zhàn)友往往非常在意他的目標(biāo)蛋白是否包涵體表達(dá)。甚至還有包涵體表達(dá)就用專門的包涵體蛋白純化方法等等。我們應(yīng)該關(guān)心的是目標(biāo)蛋白在什么緩沖體系下是可溶的，在什么緩沖體系下是不溶的！不要讓包涵體這個(gè)概念給你誤導(dǎo)。三、關(guān)于表達(dá)量我們常常在發(fā)表的文章上看到，我這個(gè)工程菌的目標(biāo)蛋白的表達(dá)量達(dá)到菌體總蛋白的30%、50%等等。我要說都是文章的作者在忽悠。不知道他們是如何定量的，用的最多的大概就是SDS-PAGE的掃描分析吧。且不說一個(gè)SDS-PAGE不能表現(xiàn)出所有的菌體蛋白，電泳
4、的染色方法、染色脫色強(qiáng)度、照片的曝光強(qiáng)度、掃描分析時(shí)的條帶選擇等等無不對(duì)這個(gè)百分比影響巨大。在公司的QC部門做的對(duì)此應(yīng)該最有體驗(yàn)，20%的條帶要它變成30%又有何難？我的觀點(diǎn)是對(duì)待表達(dá)量的描述不可定量，只能定性。如用：很低、較低、中等、較高、很高等來描述。有一個(gè)指標(biāo)與表達(dá)量密切相關(guān)，那就是單位體積的菌體量。兩者的乘積才是單位體積發(fā)酵液的目標(biāo)蛋白產(chǎn)率。與表達(dá)量相關(guān)的指標(biāo)還有純化倍數(shù)、純化收率等，這些指標(biāo)我們也常常在發(fā)表的文章中看到。同樣，我也認(rèn)為都是不準(zhǔn)確的。除非你用的是活性測(cè)定的方法，用蛋白活性收率來表
5、征。純化工藝的難易有時(shí)候也與表達(dá)量相關(guān)，表達(dá)量高時(shí)往往純化也方便的多。所以，盡量提高你的目標(biāo)蛋白表達(dá)量不只是基因工程上游和產(chǎn)量的問題，還是純化工藝開發(fā)的問題。四、菌體破碎（1）破菌前處理誘導(dǎo)表達(dá)的菌體在發(fā)酵離心后，最好先用PBS緩沖液或其它緩沖液立即洗滌一次。菌體洗滌可以去除一些培養(yǎng)基中的雜質(zhì)，及代謝產(chǎn)物，減少對(duì)后續(xù)純化的影響。如果菌體已經(jīng)凍存過，凍融的菌體可能有部分破碎，就不要洗滌菌體了。小量菌體的懸浮可以用5ml的槍頭吹打，再磁力攪拌。大量菌體的懸浮可以用分散乳化機(jī)。破菌緩沖液的用量一般為1∶10—
6、1∶20，即1g濕菌體用10—20ml的破菌緩沖液。（2）破菌緩沖液的選擇選擇何種破菌緩沖液，應(yīng)該與后續(xù)的純化方法密切相關(guān)，不能一刀切。而且，破菌緩沖液還與是否可溶表達(dá)相關(guān)。對(duì)于可溶表達(dá)的重組蛋白，一般就選用第一步層析純化的平衡緩沖液為破菌緩沖液。對(duì)于不可溶表達(dá)的重組蛋白，最簡(jiǎn)單的就是選用PBS為破菌緩沖液。在選用破菌緩沖液時(shí)，有個(gè)小小的trick，加EDTA。有個(gè)別重組蛋白很脆弱，在超聲破菌時(shí)就有大量的降解。注意，不是表達(dá)降解，而是超聲過程中降解。特別是用pET32表達(dá)的his-tag融合蛋白容易降解
7、，我運(yùn)氣好，遇到過2次這種超聲降解。第一次碰到時(shí)，害得我好苦。反復(fù)找原因，是誘導(dǎo)表達(dá)溫度？是超聲溫度過高？超聲功率？外源蛋白酶污染？……最后用EDTA解決了。在破菌緩沖液中加0.5mM的EDTA就不會(huì)降解了。推測(cè)原因，可能是大腸桿菌自身有那么一種蛋白酶，破菌釋放后就正好會(huì)攻擊我的寶貝蛋白。而這種蛋白酶是金屬蛋白酶，加EDTA后把它的槍栓（金屬離子）給卸了，我的蛋白小命也就保全了，哈哈。第二次在SDS-PAGE上看到降解時(shí)，心里就不慌了。可能有戰(zhàn)友會(huì)問，his-tag的蛋白加了EDTA后還怎么過Ni柱啊，
8、恭喜你，問對(duì)了。我的解決方案是先過離子交換柱。EDTA帶負(fù)電荷，用Q/DEAE吸附EDTA，或用SP柱吸附目標(biāo)蛋白后，再透析一下，過Ni柱純化。愛探險(xiǎn)的dora跳著舞，成功啦，youdidit！。（3）破菌方法大腸桿菌的破碎方法常用的大概有：反復(fù)凍融加溶菌酶法、超聲法和壓力勻漿法。一般來說處理菌體的量也是這個(gè)順序。凍融方法我不喜歡，處理量太少且費(fèi)時(shí)，要買溶菌酶，還是個(gè)外源蛋白。我喜歡強(qiáng)力型的超聲和壓力勻漿。超聲法是小規(guī)模和中等規(guī)模破碎菌體的
