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《包涵體的純化和復性總結(jié)》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、板塊一、大腸桿菌（這里討論的大腸桿菌為非分泌到培養(yǎng)基中的重組蛋白，是否有重組蛋白分泌到培養(yǎng)基中的工程菌我沒有見過。）一、關(guān)于菌體的量大腸桿菌表達的基因工程蛋白是純化人員最方便獲得的原料，對純化工藝開發(fā)來說幾乎沒有原料方面的限制。常看到有戰(zhàn)友用個幾毫升的菌液去做純化，對此我十分不解，同樣要做，為什么不多做點呢？很少的菌體會給純化帶來一些難以估計的問題，工藝的重復性和放大往往出現(xiàn)問題。因此，要做個好工藝就多發(fā)酵表達一些菌體吧。我做純化時，初始工藝摸索用的菌體量一般為10g左右。二、關(guān)于是否包涵體表達包涵體的
2、定義我就不講了。我要講的是，一個基因工程蛋白是否是包涵體表達的說法本身就不完全準確。至于包涵體在電鏡下的晶體顆粒表現(xiàn)等等對我們純化來說毫無意義，我相信做純化工藝的人沒有誰去看這個電鏡，也不關(guān)心。我們判斷的依據(jù)只是SDS-PAGE，目的蛋白在破菌沉淀中，我們就認為是包涵體表達，但這是一個似是而非的結(jié)論。看著沒問題，實際上是有毛病的。關(guān)鍵在于你用的是什么破菌緩沖液！有些蛋白在用緩沖液A破菌時是在破菌沉淀中，而用緩沖液B破菌時卻在破菌上清中。緩沖液A和B的差別可能只是pH上相差1-2個單位。那么它是包涵體表達
3、還是可溶上清表達呢？說這個問題主要在于有些戰(zhàn)友往往非常在意他的目標蛋白是否包涵體表達。甚至還有包涵體表達就用專門的包涵體蛋白純化方法等等。我們應該關(guān)心的是目標蛋白在什么緩沖體系下是可溶的，在什么緩沖體系下是不溶的！不要讓包涵體這個概念給你誤導。三、關(guān)于表達量我們常常在發(fā)表的文章上看到，我這個工程菌的目標蛋白的表達量達到菌體總蛋白的30%、50%等等。我要說都是文章的作者在忽悠。不知道他們是如何定量的，用的最多的大概就是SDS-PAGE的掃描分析吧。且不說一個SDS-PAGE不能表現(xiàn)出所有的菌體蛋白，電泳
4、的染色方法、染色脫色強度、照片的曝光強度、掃描分析時的條帶選擇等等無不對這個百分比影響巨大。在公司的QC部門做的對此應該最有體驗，20%的條帶要它變成30%又有何難？我的觀點是對待表達量的描述不可定量，只能定性。如用：很低、較低、中等、較高、很高等來描述。有一個指標與表達量密切相關(guān)，那就是單位體積的菌體量。兩者的乘積才是單位體積發(fā)酵液的目標蛋白產(chǎn)率。與表達量相關(guān)的指標還有純化倍數(shù)、純化收率等，這些指標我們也常常在發(fā)表的文章中看到。同樣，我也認為都是不準確的。除非你用的是活性測定的方法，用蛋白活性收率來表
5、征。純化工藝的難易有時候也與表達量相關(guān)，表達量高時往往純化也方便的多。所以，盡量提高你的目標蛋白表達量不只是基因工程上游和產(chǎn)量的問題，還是純化工藝開發(fā)的問題。四、菌體破碎（1）破菌前處理誘導表達的菌體在發(fā)酵離心后，最好先用PBS緩沖液或其它緩沖液立即洗滌一次。菌體洗滌可以去除一些培養(yǎng)基中的雜質(zhì)，及代謝產(chǎn)物，減少對后續(xù)純化的影響。如果菌體已經(jīng)凍存過，凍融的菌體可能有部分破碎，就不要洗滌菌體了。小量菌體的懸浮可以用5ml的槍頭吹打，再磁力攪拌。大量菌體的懸浮可以用分散乳化機。破菌緩沖液的用量一般為1∶10—
6、1∶20，即1g濕菌體用10—20ml的破菌緩沖液。（2）破菌緩沖液的選擇選擇何種破菌緩沖液，應該與后續(xù)的純化方法密切相關(guān)，不能一刀切。而且，破菌緩沖液還與是否可溶表達相關(guān)。對于可溶表達的重組蛋白，一般就選用第一步層析純化的平衡緩沖液為破菌緩沖液。對于不可溶表達的重組蛋白，最簡單的就是選用PBS為破菌緩沖液。在選用破菌緩沖液時，有個小小的trick，加EDTA。有個別重組蛋白很脆弱，在超聲破菌時就有大量的降解。注意，不是表達降解，而是超聲過程中降解。特別是用pET32表達的his-tag融合蛋白容易降解
7、，我運氣好，遇到過2次這種超聲降解。第一次碰到時，害得我好苦。反復找原因，是誘導表達溫度？是超聲溫度過高？超聲功率？外源蛋白酶污染？……最后用EDTA解決了。在破菌緩沖液中加0.5mM的EDTA就不會降解了。推測原因，可能是大腸桿菌自身有那么一種蛋白酶，破菌釋放后就正好會攻擊我的寶貝蛋白。而這種蛋白酶是金屬蛋白酶，加EDTA后把它的槍栓（金屬離子）給卸了，我的蛋白小命也就保全了，哈哈。第二次在SDS-PAGE上看到降解時，心里就不慌了?？赡苡袘?zhàn)友會問，his-tag的蛋白加了EDTA后還怎么過Ni柱啊，
8、恭喜你，問對了。我的解決方案是先過離子交換柱。EDTA帶負電荷，用Q/DEAE吸附EDTA，或用SP柱吸附目標蛋白后，再透析一下，過Ni柱純化。愛探險的dora跳著舞，成功啦，youdidit！。（3）破菌方法大腸桿菌的破碎方法常用的大概有：反復凍融加溶菌酶法、超聲法和壓力勻漿法。一般來說處理菌體的量也是這個順序。凍融方法我不喜歡，處理量太少且費時，要買溶菌酶，還是個外源蛋白。我喜歡強力型的超聲和壓力勻漿。超聲法是小規(guī)模和中等規(guī)模破碎菌體的
